一种基于光学模拟的荧光定量PCR仪校准方法-陈如冰.docVIP

一种基于光学模拟的荧光定量PCR分析仪校准方法* 陈如冰 胡涵星 袁伟伟 （苏州市计量测试研究所，苏州，215128） 摘 要：本文介绍了荧光定量PCR分析仪的工作原理和结构特点，提出了该仪器的校准项目，以及一种基于光学模拟的校准方法。通过采用可变光强的PCR温度校准仪和PCR荧光校准仪，合理布置温度传感器和LED光源位置，对荧光定量PCR分析仪的温度控制性能和定量准确度进行了校准，并对可能影响校准结果的不确定度分量做了说明。 关键词：聚合酶链式反应（PCR）；荧光；定量；温度；校准 中图分类号：Q819 文献标识码：A 文章编号： New Method of the Calibration for Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction Analyzer by Optical Simulation Chen Rubing Xu Hangqing Yuan Weiwei (Suzhou Institute of Measurement and Testing Technology, Suzhou 215128, China) Abstract: To study the calibration for Real-time Fluorescent Quantitative PCR, which widely used in the fields of scientific research, clinical diagnosis. The study describes the calibration items and method by optical simulating PCR process base on the specification of Real-time Fluorescent Quantitative PCR. The method of calibration is put forward to calibrate the thermo performance and quantitative accuracy of PCR analyzer by a test system designed to measure the temperature of reaction block and generate changeable light with temperature sensors and LED elements, and the uncertainty components are introduced. Key words: Polymerase chain reaction (PCR); Fluorescence; Quantitative; Temperature; Calibration 引言 PCR分析仪又称聚合酶链反应分析仪，是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction），模拟DNA或RNA复制过程，在模版、引物、聚合酶等存在条件下，对特定DNA或RNA片段进行快速扩增和检测分析的仪器设备。荧光定量PCR分析仪（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，或RT- -qPCR）是近年来快速发展起来的一种新型PCR分析仪，是在PCR过程中利用荧光染料释放的荧光能量变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，并通过对荧光的采集和分析以达到对原始模板量分析的PCR分析仪，1996年由美国Applied Biosystems公司研制推出。该仪器与传统PCR分析仪相比，具有特异性强，污染干扰少，自动化程度高等特点，可以说是PCR检测技术的一次飞跃。现今，各类医学实验室、司法鉴定实验室、检验检疫实验室和基因测序公司等都广泛应用荧光定量PCR分析仪进行各种生物学研究或检验，其使用量飞速增长。 然而，与快速增长的荧光定量PCR分析仪相比，对于此类定量PCR分析仪校准方法研究却少人涉及，国内只有高运华[1] 吴坚[2]对PCR分析涉及的质粒DNA标准物质进行了研究，朱晨彬、朱毅晨[3]，郭沈辉[4]等人对PCR分析仪的温度性能校准方法进行了研究。未对荧光定量PCR分析仪的关键参数定量准确度进行校准，不能全面反映荧光定量PCR分析仪的计量性能。 仪器工作原理和结构 2.1 工作原理 荧光定量PCR分析仪主要通过仪器内部热循环系统的升降温变化，使得DNA或RNA片段得以复制扩增，仪器光学系统采集伴随DNA或RNA扩增产生的荧光信号，并对荧光信号进行分析转化、数学运算后，得到扩增曲线。其生物片段扩增的理论方程以公式（1）表示[5]：