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综合实验一 土壤中稀有放线菌的分离和纯化 及抗生菌的体外抗菌鉴定 一 土壤中稀有放线菌的分离和纯化 1 实验目的 了解采集土样的要求和方法，掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术，学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 2 实验原理 筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。 土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。 由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。 3 仪器和材料 （1）培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。 （2）灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。 （3）其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。 4 试验步骤 （1）采土：选择适宜采样地点。用采土铲去除表土，取5～10cm深处的土壤约150g左右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。 （2）土样预处理：新鲜土样应适当风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育的影响。 （3）制备平板：每组取10套无菌培养皿，将冷却至50℃左右的各培养基，分别倒入平皿，每皿约15～20ml。每种培养基中需加入20ppm的K2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类及组号。 （4）制备土壤稀释液：每组称取10g土样，放入90ml无菌水中，得到土壤原液。手摇15～20min后，静置1min。再用无菌吸管取1ml上清液，置于9ml无菌水中，充分混匀，则得到10－2稀释液。依此类推，制备10－3、10－4稀释液（一般地，较肥的土壤使用10－3～10－5稀释液，而瘦土则使用10－2～10－4稀释液）。 （5）铺平板：用1ml无菌吸管分别取0.1ml 10－3～10－5稀释液，置于培养基平板中央。然后，再用无菌的玻璃刮铲均匀涂布，静置10min。每1稀释度3个重复，每1种培养基10套平板。并注明各稀释度。 （6）培养及观察：将各平板置于28℃恒温箱中倒置培养14天。要求分别在第2天、7天和14天进行观察，并根据菌落大小、气生菌丝有无、气生菌丝和基质菌丝的颜色及可溶性色素有无等培养特征，选择单菌落放线菌进行纯培养，同时在平板背面的相应位置上作好标记。 （7）纯培养：及时将选定的单菌落接入高氏1号琼脂斜面，每个菌株接1支斜面。必要时，中间可加1次划线分离培养，然后再转斜面。 5 结果与讨论 将实验结果填入下表。 思考题 1、在分离土壤放线菌时为什么要选用多种培养基？ 2、在培养基中添加K2Cr2O7有何作用？ 二 抗生菌的体外鉴别 1 实验目的 了解抗生素产生菌体外筛选法的原理，学习并掌握抗生菌的鉴别方法。 2 实验原理 由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。本实验选用了这两种方法。 3 仪器与材料 （1）培养基：500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂，18×180mm试管分装4ml黄豆饼粉浸汁，300ml三角瓶分装150ml细菌培养基，150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。（2）试验菌： 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 大肠杆菌（Escherichia coli） 金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus） 深红酵母（Ruodotorula rubra） （3）待测菌株： 琼脂培养物：将融化的黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿，制成平板。用记号笔在平皿背面画一直线，将平