利用16S rDNA克隆文库研究猪场污水微藻净化后菌群的变化.docVIP

利用16S rDNA克隆文库研究猪场污水微藻净化后菌群的变化 　　摘要：为促进猪场污水治理，研究微藻净化对猪场污水菌群的影响，将小球藻接种于含60%沼液与40%水的猪场污水进行批式模式培养，循环三次后将小球藻液离心，检测猪场污水、小球藻液以及离心后上清液中的水质指标及菌群变化情况。菌群采用16S rDNA克隆文库方法检测。结果显示，和猪场污水相比，小球藻液及上清液中的化学耗氧量（COD）、总氮、氨氮、总磷、铜、锌等含量极显著降低（P0.01）。除未知菌群外，猪场污水中的主要菌群为Firmicutes 群和Bellilinea群，含量分别为12.25%和11.22%；小球藻液中主要菌群为小球藻和Cytophaga 群，含量分别为42.42%和12.12%；上清液中的主要菌群为Dyadobacter、Cytophaga、Algoriphagus 群和Pedobacter 群，含量分别为25.00%、14.00%、11.00%和10.00%。猪场污水和小球藻液中未发现共存的微生物，小球藻液与上清液中皆含有Cytophaga群和Dyadobacter、Pseudomonas、Flavobacterium、Algoriphagus、Flexibacter群。表明接种小球藻可以净化猪场污水中的氨氮、总磷以及重金属，改变污水中的菌群，污水净化可能是小球藻和其共存菌共同作用的结果。 　　关键词：小球藻；猪场污水；16S rDNA克隆文库；净化；菌群 　　中图分类号：S828.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）02-0093-06 　　随着集约化养殖业的发展，粪污污染问题日益引起人们的重视。随着2015年国家《水污染防治行动计划》及2016年国家《土壤污染防治行动计划》的实施，粪尿处理问题尤其需要解决。由于总体畜禽养殖利润低、污水处理设施投入高、处理后的水价格低，且养殖户处理污水的意愿不高，养殖污水处理成为目前养殖污染处理的难点之一。和城市污水、工业污水相比，养殖污水量大，氮、磷含量高，水体微生物成分复杂，且可能含有致病菌，因此养殖污水处理难度更大。 　　微藻因适应性强，生长速度快，能够利用污水中的氮、磷[1]，并且具有抗肿瘤、抗高血压[2，3]等生理功能而受到畜禽养殖业的广泛关注。利用微藻处理污水不但可以降低污水处理设施的高投入，而且可以用廉价的污水生产高附加值的微藻饲料、微藻保健品等。微藻自20世纪70年代起开始用于污水处理[4]。菌藻共生技?g的出现进一步提升了微藻处理污水的效果[5]。由于微藻处理污水的效果受水体中微生物以及外源微生物的影响[6]，明确微藻净化污水过程中微生物的变化有助于进一步明确微藻净化污水的机理、提升菌藻共生技术、增强污水处理效果及促进微藻的生长，从而促进水资源的高效利用。但养殖污水中微生物种类及含量不明，制约了其高效利用。传统的微生物培养方法存在耗时长、工作量大、绝大多数微生物不能培养等缺点，无法准确确定污水中的微生物。16S rDNA克隆文库不需要环境中微生物的纯培养，能够更全面系统地揭示各种未知的微生物，目前已应用于油田及燃料[7]等，但尚未见用于养殖污水的报道。本研究采用16S rDNA克隆文库技术分析微藻净化的猪场污水中菌群的变化，可为猪场污水治理提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　小球藻（Chlorella vulgaris），烟台大学提供。猪场污水，烟台市某猪场提供，为60%沼液与40%水。Stool DNA试剂盒，美国OMEGA公司生产。pMD18-T Vector试剂盒以及Ex Taq HS DNA热启动聚合酶，宝生物工程（大连）有限公司提供。GenEluteTM Gel Extraction Kit胶回收试剂盒，美国Sigma Aldrich公司生产。 　　1.2小球藻净化猪场污水及水质指标检测 　　将小球藻接种于1.5 L以猪场污水为培养液的柱状光生物反应器中，小球藻初始接种浓度为OD680=0.3，人工光源24 h连续光照，光照强度为150 μmol/（m2?s），培养温度为23～28℃，空气流量为0.2 L/min。培养开始时采用批式模式培养。当培养液中污染物浓度降低至《畜禽养殖业污染物排放标准》所规定的允许排放浓度以下时，再用50%体积比的猪场污水以50%的体积比置换培养液，继续进行光照培养，如此循环三次。最终将小球藻溶液5 000 r/min离心10 min后收集上清液。利用小球藻共净化猪场污水三批，每批将猪场污水、最终的小球藻液、离心后的上清液样品各采集三个重复，用于水质指标检测。 　　COD根据GB/T 11914―1989检测，总氮含量根据HJ 636―2012检测，氨氮含量根据HJ 535―2009检测，总磷含量根据G