环境微生物学-郑平-教学课件-13监测.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Ames试验法检测结果 （引自Madigan M T et al, 2006） 上图对照滤纸圈上不加化学物质，下图试验滤纸圈上添加化学物质。 添加化学物质后，滤纸圈周围的菌落数明显增加。 * * 2. Ames试验法的优点 （1）准确性高。将175种已知致癌物进行Ames试验，157种呈阳性反应，吻合率达90％。将108种已知非致癌物进行测定，94种呈阴性反应，吻合率为87％。 （2）样品量少。可检出微克至毫微克水平污染物的致突变性。 （3）综合性强。可检出多种污染物混合物的致突变性，反映其联合效应。 * * 3. Ames试验法的应用实例 1964年日本开始使用呋喃基糠酰胺作为食品添加剂。 采用大鼠、小鼠做致癌性试验，结果阴性。 1974年采用Ames试验法做致突变性试验，结果阳性。 大规模动物实验印证，呋喃基糠酰胺确属致癌性物质。 日本政府宣布禁用呋喃基糠酰胺作为食品添加剂。 返回 * * 第四节 目标微生物的分子生物学检测 一、PCR-DGGE技术 PCR-DGGE技术是PCR（polymerase chain reaction）技术和DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）技术的组合。该技术已成为环境微生物研究的重要手段，在污染菌跟踪检测中的作用也越来越大。 * * （一）PCR-DGGE技术的原理 16S rRNA是原核生物核糖核蛋白体的组成成分，其大小约为1500bp。每种原核微生物都有特定的16S rRNA序列。从样品中提取微生物总DNA，用特异性引物对16S rDNA（编码16S rRNA的基因）进行PCR扩增，再采用DGGE技术分离扩增产物，通过测序获得样品中的16S rDNA序列信息，再与16S rDNA数据库中的序列数据进行比对，建立系统发育树，即可鉴定样品中的原核微生物种类。 * * PCR-DGGE技术原理 （引自Madigan M T et al, 2006） * * （二）PCR-DGGE技术的应用 1. 检测致病菌 单核细胞增生利斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种引起人类脑膜炎的致病菌，广泛存在于蔬菜、肉类和家禽上。1992年，Niederhauser等人应用PCR-DGGE技术扩增该致病菌中的hlyA和iap基因，检测时间只需几个小时。采用这种技术检测100个样品，阳性检出率显著高于经典培养法。 * * 2. 检测基因工程菌 1989年，Chaudry等人将一个基因工程菌接种于经过过滤除菌的湖水及污水中，定期取样，采用PCR-DGGE技术扩增该工程菌的标记物（0.3kb DNA片段）。跟踪监测结果表明，接种10~14天后，仍可在样品中检测到该基因工程菌。 返回 * * 二、BIOLOG技术 BIOLOG技术由美国BIOLOG公司于1989年研发成功，最初根据各种细菌的代谢指纹（metabolic finger print）来鉴定被分离纯化的微生物种群，至今已能鉴定包括细菌、酵母和霉菌在内的2000多种环境微生物。 * * （一）BIOLOG技术的原理 BIOLOG技术通过微孔板（microplate）实施。微孔板上有96个孔穴，预先在96个孔穴内加四唑染料，并在其中95个孔穴内分别加95种碳源物质，剩下1个孔穴不加碳源物质作为对照。将微生物接种至微孔板的各孔穴内，若微生物能够利用其中的碳源物质，则可通过氧化还原反应使四唑染料变为紫色，颜色深浅可反映微生物对碳源物质的利用程度。由于微生物对不同碳源物质的利用能力取决于菌种特性，因此反过来可以根据微生物对95种碳源物质的利用能力来鉴定菌种。 * * （二）BIOLOG技术的操作 BIOLOG技术的操作程序 操作程序 说明 平板选择 样品制备 样品添加 培育与读数 针对G+和G-细菌选择不同平板（BIOLOG GP或BIOLOG GN）。 从环境介质中提取微生物，控制适宜浓度（以浊度表示）。 取一定体积菌液（一般150 μL/孔），平行加入各孔穴。 恒温培育，用微平板读数器记录各孔穴吸光度值的变化。 返回 * * 三、FISH技术 FISH（fluorescence