蛋白质及的研究方法.ppt

* 动态弹性光散射 是通过测定蛋白颗粒的直径、然后与标准蛋白样品比较而推算蛋白分子质量的方法。 这种测定技术也可通过观察样品是单分散性的（monodispersed）还是多分散性的（polydisper- sed）而反映所测蛋白样品是否均一。 * 孔径梯度电泳 通过制备具有一定范围的从大到小孔径梯度的聚丙烯酸胺凝胶，然后让蛋白在非变性条件下在这种凝胶上电泳而进行的。 经过低电流条件下的较长时间的电泳，蛋白质分子将在凝胶中与其直径相等的孔径处停下（因为再往下凝胶中的孔径比蛋白直径小）。通过与同时在胶中电泳的标准样品比较我们就可以知道蛋白在这种非变性条件下的分子质量。 优点：１.所获得的是天然状态下的蛋白分子大小。 　　　 2. 如果蛋白分子能够在这种低电流电场中长 　　　　 时间保持稳定的话，这种方法比较经济。 * 质谱 质谱是一种在化学中被广泛采用的、测定原子或分子质量方法中最直接、最准确的方法。 * 用质谱测定蛋白质分子质量的总的原理： 首先纯化好的蛋白样品要被转变成挥发和带电（即解离）状态， 电离后的蛋白质分子（带有多个电荷）然后进入一个真空加速电场中， 之后，不同质荷比（m/z）的蛋白分子表现出的行为〔或者在外加磁场中的偏转、或者抵达固定探测器的所谓“飞行时间（time of flight, TOF) 〕不一样。 利用所测得的质荷比以及蛋白所带的电荷值，计算机软件很快就会正确地给出所测蛋白分子的质量。 * 　　用质谱测定蛋白质的分子质量，精确一般可达0.01%，是目前进行蛋白质分子量测定最准确的方法（其准确度超过SDS、弹性光散射和孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳，甚至分析超速离心等）。 质谱技术现在也可直接用于： 　　　　　　　　氨基酸序列的测定 　　　　　　　　蛋白质的翻译后修饰的鉴定 　　　　　　　　蛋白质组学研究工作。 * 四、测定蛋白质的氨基酸序列 蛋白质被纯化出来，需要进一步获取其基因序列， 最好测定其部分的或全部的氨基酸序列。 　自动氨基酸测序仪 * 五、用抗体探测特异蛋白质分子 抗体是当外源入侵物（包括蛋白质）与脊椎动物体内的免疫系统接触后产生的、能与入侵物特异结合的防御性蛋白质分子。 这种高度特异、高度灵敏的抗体一抗原结合反应现在被广泛地应用于检测微量蛋白的存在情况。 * 目前应用抗体研究蛋白质的方法主要包括下面几种： １.蛋白质印迹 2. 免疫共沉淀 * (一）蛋白质印迹（Western blotting） 是一种使用广泛的检测蛋白质的方法。 这种方法与研究核酸时用的印迹法原理非常类似－－ 蛋白质印迹法是利用抗原一抗体之间的特异结合反应 而检测的； 核酸类的印迹法是利用核酸分子之间通过特异碱基配 对法则而形成杂交分子这一原理而检 测的 * 蛋白质印迹－－ 检测时，蛋白质混合物（一般是细胞抽提物）通过电泳被分开，蛋白质被（一般通过电场的作用）转移到一种特别的膜（如硝化纤维膜等）上，然后让特异的抗体与固定在膜上的特异抗原蛋白结合 抗原一抗体之间结合的高度特异性使得用某种蛋 白质分子制备的特异抗体分子只与膜上的这种蛋白质分子结合，而不与膜上存在的成千上万种其他蛋白质发生相互作用。 * 结合了特异抗体的蛋白质条带可以通过能与结合在抗原蛋白上的所谓“第一”抗体结合的、被一种特异的酶／化学发光基团／荧光基团／放射性同位素标记的“第二”抗体进行显示。 这样我们可以知道与特异抗体对应的抗原蛋白在检测的蛋白混合物中是否存在？相对量是多少？如果蛋白混合物是通过SDS分开的话，被检测蛋白的分子量也一目了然。