绿脓杆及菌课件.pptVIP

化妆品中铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的检测;目的： 　1.了解化妆品中铜绿假单胞菌检测的基本过程。 　2.掌握几种培养基的配置方法。 　3.掌握铜绿假单胞菌的鉴定及生化特征。 原理： 铜绿假单胞菌为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，在普通培养基上生长良好，菌落大小不一，平均直径2mm～3mm，扁平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态。氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，此外还能液化明胶，还原硝酸盐产生氮气，在42℃条件下可以生长，可与类似菌区别。;操作步骤;操作步骤;实验一 培养基的制备及细菌的分离培养　;实验目的;实验原理;操作步骤;操作步骤 ;注意事项;细菌的分离培养;方法： 平板划线法有几种，可根据不同情况选用其中一种。 (1)平行划线法 此法适用于含菌不多的液体标本，如脑脊液(CSF)、腹水、分泌物、脓汁以及稀薄的菌液等。 ①左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本，先在平板的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线，约占平板面积的一半。 ②将平板转180°角，从平板另一端开始也划密集的平行线，直到划满平板的剩余部分。 将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将平板倒置，37℃培养。 ;(2)分区划线法。此法适用于含菌多的检测标本，如粪便，喀痰、细菌固体培养物等。 ①划线前的操作同平行划线法。先在平板的一端将标本涂开并在平板的1/5～1/4面积上划密集的平行线，接种环火焰灭菌。 ②将平板转约70°角，待接种环冷却后，使接种环通过已划线的1区5～7次，以后即不与1区接触作连续密集划线，约占平板面积的1/4，接种环再通过火焰灭菌。 ③再转平板约70°，如上法在第3区划线，此后接种环不再灭菌。 ④重复上述操作在第4区划线，划满余下的培养基表面。将平板底放入盖内，接种环灭菌后放下，置37℃培养。;实验二 染色镜检及五项指标试验　;革兰氏染色方法;4．染色： ①初染:将结晶紫染液加于涂膜上，1min。 ②媒染:水洗后加芦戈氏碘液处理，1min。 ③脱色：水洗后用95％乙醇脱色，并摇动玻片，直至流下的液体无色为止，约需0.5min。 ④复染：水洗后加石炭酸复红稀释液染色，1min。 ⑤水洗，用滤纸吸干，待标本充分干燥后进行镜检。 5．镜检： 　干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 。 ;注意事项：;革兰氏染色方法操作步骤; 铜绿假单胞菌镜下形态图示：;氧化酶试验;实验三 结果观察及报告　;绿脓菌素实验：2~3个可疑菌落→绿脓菌素培养基→37℃ 24h →3~5mL氯仿→振荡 提取液呈蓝色→取液体于一新试管+1mL1mol/L盐酸 上层盐酸内变为红色为阳性，不变色则为阴性。 硝酸盐还原产气实验：可疑菌落→硝酸盐蛋白胨水→ 37℃ 24h →小倒管内有气体产生为阳性，否则阴性。 ;明胶液化实验：可疑菌落→穿刺接种于明胶培养基→ 37℃ 24h →取出放冰箱10~30min 呈溶解状为阳性，不溶解则为阴性。 42℃生长实验 ：可疑菌落→普通琼脂斜面→42℃ 24h→铜绿假单胞菌生长，而近似的荧光假单胞菌不能生长 。;结果判断; 革兰氏染色（Gram staining）:革兰氏染色法是由丹麦医生Gram于1884年创立，其简要操作分初染→媒染→脱色→复染。如果染色得当，镜检发现G+菌体呈蓝紫色，G-菌体呈浅红色。通过革兰氏染色法可把所有细菌分两在类。因此它是分类鉴定菌种的重要指标。其染色机制：通过初染和媒染操作后，在细菌细胞的膜或原生质体上染上了不溶于水的结 晶紫与碘的大分子复合物。革兰氏染色阳性（Gram Positive）:革兰氏阳性菌由于细胞壁厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧 密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，再加上它基本不含类脂，故用乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此结晶紫与 碘复合物仍牢牢阻留下其细胞壁内，使其呈现蓝紫色。 革兰氏染色阴性（Gram Negative）:革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，这样，结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时，再经番红等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性获得了浅红色。