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HPLC - 液相色谱入门 什么是液相色谱? 历史概述和定义 液相色谱的定义是二十世纪早期由俄罗斯植物学家 Mikhail S. 茨维特提出的。他最先尝试在装满颗粒的 柱子上使用溶剂来分离从植物中提取的化合物[树叶色素]。茨维特用颗粒填满开口的玻璃柱。他发现两种 特殊的材料，粉笔末(碳酸钙)和氧化铝很有用。他将样品[混匀植物叶的溶剂提取物]倒入柱中，并让样品 流过颗、粒床。随后加入纯溶剂。随着样品由于重力自上而下流过柱子，可看到不同颜色的谱带被分开， 因为有些组分比另外一些移动得快。他将这些分开的不同颜色的谱带与样品中原有的不同化合物相关联。 他还根据每一种化合物对填料的化学亲和性强弱，提出了分析这些化合物的分离规律。与颗粒填料有较强 亲和性的化合物移动慢，与溶剂有较强亲和性的化合物移动快。这个过程可这样描述:样品中的化合物在流 动的溶剂(流动相)与固体颗粒(固定相)间的分布不一样。这样使每一种化合物以不同的速度移动，从而产 生了化合物之间的分离。 茨维特使用色谱法 chromatography [来自希腊字， chroma 意思是颜色， graphy 意思是记录 - 直 译为颜色记录] 来描述他的彩色试验。[令人好奇的是, 俄罗斯名字茨维特意思是颜色。]今天，液相色谱 法,以各种形式，已成为分析化学中最有力的工具之一。 技术 1. 样品被点在固定在玻璃板上的薄层色谱颗粒[固定相]上，并流过薄层[图 B] 。玻璃板的底端放置 在溶剂中。由毛细作用产生的流动使溶剂[流动相]扩散到干燥的颗粒层并沿玻璃板向上移动。这种技术被 称为薄层色谱法或 TLC 。 技术 2. 在图 C 中, 样品被点在纸上[固定相]。溶剂[流动相] 加在样品点的中心以产生向周围的辐射流 动。这是纸层析的一种方式。[传统的纸层析色谱和直线流动的薄层色谱是类似的操作方式。]上图中，相 同的黑色 FD 和 C 染料被点在纸上。 图 C: 纸层析法 当和薄层色谱板比较的时候，请注意这种特殊纸张分离能力的区别。绿色圆环表示这张纸无法分离黄色和 蓝色染料，但它可以将红色染料分离开来。下图中，由同样的黄色和蓝色染料组成的一个绿色样品点在纸 上。如你能预料的，这张纸无法分离这两个染料。在图中，由红色和蓝色组成的紫色样品被点在纸上，它 们被分离得 很好。 技术3.在这个最有效的方法中，样品流进一个柱子或填有适当颗粒[固定相]的柱管装置。这些颗粒称为色 谱填料。溶剂[流动相]流过这个装置。在固相萃取中[SPE]，样品被装入柱管里，溶剂携带样品流出这个 装置。正如在茨维特的试验中，样品中化合物由于在管路中的流动速度不同而得以分开。黑色样品被放入 柱管里。每一步使用不同溶剂得到分离。 图 D-1: 柱色谱法 - 固相萃取 [SPE] 当使用管路的形式时，有几种方法可以产生流动。重力或真空可用在不能承受压力的柱子上。特别是，本 试验中使用的颗粒粒径较大[大于五十微米]，所以产生的流动阻力很小。开口玻璃柱[茨维特的实验]是个 典型的例子。除此之外，小型塑料柱，典型的例子是针筒的形状，可装入填充物颗粒用于分离样品。这种 方法称为固相萃取[SPE]。在此，管状的色谱装置称为固相萃取小柱，通常在真空助力下流动，被用来净 化复杂样品以便进一步分析。要想提高分离能力，必须使用粒径小的填料颗粒[小于十微米]。然而，小颗 粒对流动产生更大的阻力，所以要获得预期的溶剂流速，需要更高压力。必须设计能承受更高压力的泵和 柱子。利用中高压力使溶剂流过色谱柱的方法，就称为 HPLC 。 图 D-2: HPLC 柱 什么是高效液相色谱法[HPLC]? 缩写 HPLC, 引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大会上的文章，原