实验二、染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列.ppt

现代微生物学实验技术 马 玉 超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话 Email:myc0307@ 实 验 内 容 ♣ 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ♣ 转座子随机突变及目的表型的筛选 ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导 ♣ 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 用户名：xdwswsy@126.com 密码：112233445566 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 —TAIL-PCR 牛伯庆 许梦秋 实验目的 掌握TAIL-PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 掌握TAIL-PCR的实验流程，为将来课题研究奠定基础。 a hot arbitrary degenerate primers: AD1：5´-TG(A/T)GNAG(A/T)ANC(G/C)AGA-3´； AD2：5´-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3´； AD3：5´-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3´； AD4：5´-TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3´。 TAIL-PCR 的原理 sp1 sp2 sp3 已知序列 未知序列 特异引物序列： sp1:TGGAGAACTT GTAACCCTTG GTG sp2:TGGCGAGTGAGACGACGAGT sp3:CGAGCAGATGGTTCTTGG TAIL-PCR:Thermal asymmetric interlaced PCR Liu et al., 1994 TAIL-PCR 的原理 实例：微生物法生产丙烯酰胺 微生物法生产丙烯酰胺 氮代谢网络 Nitrile Hydratase (NHase) 课题背景-腈水合酶代谢酶系研究进展 腈水合酶代谢酶系研究进展 Nocardia asteroides ATCC 19247T (DQ659898) 微生物法生产丙烯酰胺的菌株鉴定 Neighbour-joining tree showing the phylogenetic position of R. ruber strain TH with respect to Rhodococcus species based on 16S rDNA gene sequence. Nocardia asteroides was used as an outgroup. Numbers at branching points represent bootstrap values from 1000 replicates, and the cutoff was 50%. Bar, 0.1 substitutions per nucleotide position. Scanning electron micrograph (A) and transmission electron micrograph (B) of the strain TH grown on LB at 48h. Bars, 5 μm 11 产腈水合酶的菌株 腈代谢相关基因的克隆与序列分析 腈水合酶基因侧翼序列的克隆策略 酰胺酶基因侧翼序列克隆的策略 Sequence the segments of TAIL-PCR 2487bp amiE 2136bp 腈代谢相关基因的克隆与序列分析 9.6kb 5.6kb 腈水合酶基因簇 酰胺酶基因簇 RNA聚合酶的亚基组成 转录 翻译 表型 RNA聚合酶 DNA mRNA 蛋白质 全局调控 突变库构建 (Hal Alper, et al. Science. 2006) RNA聚合酶 Sigma 因子的功能 1 CGCCTCCGCC GACTCGGTGC GCGCCTACCT CAAGCAGATC GGCAAGGTTG CCCTGCTCAA 61 CGCCGAGGAG GGGGTCGAGC TCGCCAAGCG CATCGAGGCC GGCCTGTACG CGACCTACCG 121 GCTGCAGGAG TACGCCGACA AGGGCGAGAA GCTGCCGGTC GCGCAGCGCC GCGACCTGAA 181 CTGGACCTGC CGCGACGGCA ACCGCGCCAA GAACCATCTG CTCGAGGCCA ACCTGCGACT 241 CGTCGTCT