研究生 测序.ppt

* * * * 克隆DNA 生成一系列荧光标记的仅差别一个碱基的DNA混合物 DNA分子的分离 检测荧光，读取DNA序列 单一DNA序列长度500～1000bp 每台测序仪每次运行可生成57000 bp序列 将序列拼装成基因组 总结 第一代测序的基本流程 第二代测序，也称下一代测序（next-generation sequencing），将片段化的基因组DNA两侧连上接头，并用不同方法产生多个空间固定的PCR克隆阵列。然后进行引物杂交和酶延伸反应。 由于所有克隆均位于同一平面，这些反应就能够大规模平行进行，通过检测荧光，可获得测序数据。 不断重复序列延伸和成像检测，最后经过计算机分析即可获得完整DNA序列信息。 第二代测序 提取DNA 将DNA连接在某种介质上 延伸与扩增DNA 通过显微镜检测荧光信号，生成一系列短序列 单一DNA序列长度约30～300bp 每次运行生成0.4 ～4 GB数据 作图，或将数据与基因组序列进行比对 第二代测序的基本流程 3 Gb == 第一代与第二代测序成本比较 第一代 第二代 Roche 454 GS FLX: 焦磷酸测序 (pyrosequencing), 乳液PCR (emulsion PCR) Illumina Solexa GA: reversible terminator 以上为基于合成的测序(sequencing by synthesis, SBS) 技术 Appled Biosystems SOLiD: 基于连接的测序(sequencing-by-ligation), 乳液PCR 第二代测序的三种技术 Roche 454 Genome Sequencer FLX 454公司于2005年提出该技术，2007年推出优化的GS FLX Roche于2007年并购454公司，以不到100万美元的成本测定Watson的基因组序列 2010年将推出初级版的GS Junior，预计每次反应得到10万条序列，适用于小型实验室 核心技术：焦磷酸测序 pyrosequencing 454 基因组测序原理 Roche 454 GS FLX 的优缺点 单一反应片段长 (up to 400 bp), 设计用于从头测序 (de novo sequencing) 如用于重测序 (resequencing) 则成本过高 因此，454系统最适合用于新基因组的测定 Baylor Genome Center involved in Sea Urchin, Bee, Platypus genomes: They have a number of 454. Illumina Solexa Genome Analyzer 2005年由Solexa公司研发，2007年正式上市 采用基于合成的测序 (sequencing by synthesis, SBS) 原理 性价比最高的第二代测序技术 核心技术：DNA合成的可逆终止 reversible terminator Solexa 基因组测序原理 单次运行可完成5000万通道测序 Illumina Solexa GA 的优缺点 单一反应片段短 (30-50 bp), 不能用于复杂真核基因组的从头测序 性价比最高，重测序 (resequencing) 首选 与Sanger测序仪 (3730, Megabase, etc) 或Roche 454 GS FLX联合使用测定复杂基因组 Applied Biosystems SOLiD 3 plus 2005年提出原理，2007年正式推出 采用基于连接的测序 (sequencing-by-ligation) 原理 准确度最高 (99.999%) 的第二代测序技术 核心技术：基于连接的测序 SOLiD 测序原理 1. DNA扩增与固定 SOLiD 测序原理 2. Oligo探针 SOLiD 测序原理 3. 连接酶循环反应 最终，每个碱基可以得到两次测定 SOLiD 测序原理 4. 将荧光信号转换为序列 ABI SOLiD 的优缺点 与Solexa一样，单一反应片段短，只能用于简单基因组的从头测序而不能用于复杂基因组 测序准确度最高 (15X覆盖率可达99.999%), 通量最高 (单次运行 4 GB数据) 与Sanger测序仪 (3730, Megabase, etc) 或Roche 454 GS FLX联合使用测定复杂基因组 第二代测序三种技术及Sanger法的对比 第二代测序的应用 从头测序: 454或Sanger 加上 Solexa/SOLiD. 2009年完成黄瓜基因组, Solexa+Sanger, 3.9倍用Sanger法得到, 68.3倍用Solexa得到 重测序: 200