第14章2高效液相色谱-2012应化.pptVIP

高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 高效液相色谱 一 概述 二 液相色谱仪 三 HPLC 检测器 四 各种色谱方法 五 HPLC分离利用 一、概述 － 特点 GC与HPLC比较 一、概述 - 分类 (1) 分配色谱 (2) 吸附或液固色谱 (3) 离子色谱 (4) 凝胶色谱或尺寸排阻色谱 二、各种色谱方法 （一）分配色谱 （二）吸附色谱 （三）离子交换色谱法 （四）排阻色谱法 （一）分配色谱 分配色谱 （一）分配色谱 – 分离原理 （一）分配色谱- 固定相 R --- 极性基团 疏水基团 HPLC的固定相的化学构造 非键合相表面 键合相表面 ODS C18 C8 C1 Phenyl -NH2 -CN （二）吸附色谱 – 分离原理 分离原理 （三）、离子交换色谱 （四）排阻色谱法 大分子不能进入多孔中，不被保留，随 Vm流出 中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。 （四）排阻色谱法 高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离。 HPLC应用概图 三、液相色谱仪 流动液贮存提供脱气 输液泵 进样系统 分离系统 检测系统 控制与记录系统 1. 流动相贮存与脱气 （1）真空泵抽滤系统 （2）低溶性惰性气体导入替换 （3）超声脱气 2. 输液系统 活塞泵 注射泵 气动泵 活塞泵工作原理 注射泵 3. 进样系统 不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀 样 品 环 常用的柱子 微柱 5. HPLC 检测器 溶液：折光，介电常数，密度 溶质：吸光光度，荧光光度，扩散电流等 （1）. 吸光检测器 （2）. 红外检测器 （3）. 荧光检测器 （4）. 折光检测器 （5）. 电化学检测器 （6）. 质谱检测器 常用LC检测器 （1）吸光检测器 单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光片可以到254，280，313，334，365等。生化中用到很多。 多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光 典型光路 Diode Array - Details (2) 荧光检测器 荧光强度与溶液浓度的关系： 荧光强度正比于吸收的光量与荧光量子产率F I f = F I a I f --- 荧光强度 Beer’s Law: Ia = I0 –It = I0(1-10-elc) I 0 _--- 入射光强度 ；I t ---透射光强度 elc≤0.05, e-2.3elc = 1 – 2.3 elc If = 2.3 F Io elc If = Kc （2）荧光检测器 灵敏度比吸光好，选择性亦较好，光源可以使高强度汞灯或氘灯，但并不是所有物质都有荧光，可通过柱前或柱后衍生法来检测。 （3） 折光检测器 优点：通用性好，不受流速影响 缺点： 折光率测定受温度影响很大 0.00X℃ 不能用于梯度淋洗 灵敏度有限 应用：制备色谱中常用 (4) 蒸发光散射检测器 Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) （5）电化学检测器 四、HPLC分离利用 标准样品法 谱库 HPLC-FTIR HPLC-MS 用反相液-液色谱分离稠环芳烃 苯 萘 联苯 菲 蒽 萤蒽 芘 4、色谱柱 柱长：5cm – 25cm 内径：3-5 mm 粒径：3-5 μ m 柱管：不锈钢 柱长：15cm 或25cm 内径：4.6 mm 粒径：5 μ m 塔板数：40000-70000 plates/meter 10000 plates/column 柱长：3cm -7.5cm 内径：4.6 mm 粒径：3-5 μ m 塔板数：100000 plates/meter 保护柱（guard column) 置于分析柱前的短柱，填料与分析柱基本相同，但粒径略大，避免增大柱压。用于除去污染物 名称 使用量 商品化 灵敏度