蛋白组学培训教材.pdf

第一届植物蛋白质组学必威体育精装版研究技术免费培训班 培训教材 主办单位：中国热带农业科学院 承办单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所 热科院大型仪器共享中心 热带作物蛋白质组研究中心 植物抗逆整合生物学实验室 第一部分 蛋白质提取与传统双向电泳技术培训教材 附录 参考文献及全文 第二部分 蛋白质DIGE 培训教材 注意事项 参考文献及全文 第三部分 蛋白质iTRAQ 培训教材 参考文献及全文 蛋白质双向电泳培训手册 一、 植物蛋白质提取 1. TCA-丙酮法 （1）称量一定量的样品置于液氮预冷的研钵中，加少许PVPP ，反复加液氮研磨至粉末。 （2 ）研磨好的样品用10 倍体积（w/V ）的10%的TCA-丙酮溶液悬浮，加入0.1 M PMSF、 1 M DTT 至终浓度为1 mM PMSF、10mM DTT，超声5 分钟，于-20 ℃静置6 小时或 过夜后，4 ℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。 （3 ）沉淀用10 倍体积于样品的丙酮溶液重悬浮，于-20 ℃静置 1 小时后，4 ℃，20000g 离 心15 分钟，弃上清。 （4 ）重复步骤 （3 ）一次。 （5 ）沉淀用10 倍体积于样品的乙醇/ 乙醚=1:1 洗，于-20 ℃静置1 小时后，4 ℃，20000g 离 心15 分钟，弃上清。 （6 ）重复步骤 （3 ）一次。 （7 ）取出沉淀真空干燥约5 分钟，除尽有机溶剂。 （8 ）按10mg 干粉末加200 微升裂解液的比例，加入1 mM PMSF、10mM DTT，超声5 分钟，充分溶解1 小时，10℃，35000g 离心30 分钟，上清为所需的蛋白溶液。 （9 ）用Bradford 法测定蛋白样品的蛋白浓度。 （10）蛋白样品溶液小量分装，-80℃保存。 注意事项： （1） TCA 有利于去除酚类色素等物质，但不利于蛋白的抽提，使用浓度不宜过高，在后 面丙酮处理中，尽量除去。 （2 ） 蛋白样品保存：样品浓度不宜过高，建议将高浓度样品适度调整，为避免反复冻融 应分装保存，长期保存用-80℃，短期保存用-20 ℃。 （3 ） 1M DTT：0.1542g DTT 用1ml MilliQ 水溶解，-20 ℃保存。 （4 ） 0.1M PMSF ：0.0174g PMSF 用1ml 异丙醇溶解，-20 ℃保存。 2. 酚抽提法 （1）采集植物组织后液氮速冻，置于预冷研钵中，并加入1% PVPP 粉末防止氧化，充分研 磨成干粉后，-80℃保存备用。 （2 ）称取3g 左右植物组织粉末，加入盛有10 ml 预冷BPP 提取缓冲液的50 ml 离心管中， 室温涡旋震荡10 分钟。 （3 ）加入等体积Tris 饱和酚，室温涡旋震荡 10 分钟。 （4 ）BPP 提取缓冲液配平，4 ℃，16000g 离心15 分钟。 （5 ）转移上清液（绿色的酚相）于新的50ml 离心管中，加入等体积BPP 提取缓冲液，室 温涡旋5 分钟。 （6 ）BPP 提取缓冲液配平，4 ℃，16000g 离心15 分钟。 （7 ）重复步骤 （4 ）、（5 ）一次。 （8 ）取10 ml 离心管，每管预先加入冷的5 ml 过饱和硫酸铵甲醇溶液（即AM 沉淀剂）， 取离心后的上清液1 ml，分装入含有5 mlAM 沉淀剂的离心管中，于-20 ℃沉淀过夜， 可保存数月。 （9 ）AM 沉淀过夜的上清液（可见白色沉淀物）用AM 沉淀剂配平后于4 ℃，16000g 离心 15 分钟，弃上清。