重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆与表达.PDFVIP

重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆和表达* 谢琪璇 余巍 潘善培 肖銮娟 彭雅林 张春雪 （暨南大学生殖免疫研究所，广东广州 510632 ） 摘要 为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽 （rHCMVp）， 根据其基因序列，设计引物从 pPIC9K-rHCMVp 上扩增得到目的基因片段，并导入毕赤酵 母诱导型表达载体 pPICZ αA 中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母 X33 细胞 中，筛选获得表达量较高的重组菌株，研究了该菌株生长的培养条件，包括不同诱导时间、 甲醇浓度、pH 值对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响。2 Ｌ发酵罐进行了高密度发酵，经 1% 的甲醇、pH6.0 的条件下诱导 48h ，最终菌体密度 OD600 达到 180，每升发酵液中含目的蛋 白 78.7mg，比摇瓶提高了 4.8 倍的产量。rHCMVp 可通过高密度发酵大量获得。 关键词 重组人巨细胞病毒嵌合肽 毕赤酵母 高密度发酵 人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）潜伏感染非常普遍，孕妇原发或 HCMV 复发感染均可引起新生儿宫内感染或围产期感染，可导致胎儿畸形智力低下和发育迟缓等。 HCMV 感染可对器官移植病人和免疫缺陷病人造成严重的危害，同时，HCMV 感染也是多 种疾病产生的潜在因素[1] 。因而建立 HCMV 的快速检测方法具有重要意义。多种 HCMV 病 毒蛋白可刺激机体产生相应的抗体，选用抗原性强、特异性好的蛋白抗原代替全病毒 以检测 HCMV 感染，是提高 HCMV 感染诊断 的敏感性和特异性的有效途径 。国外的研究证实 ， HCMV 的 gp52 蛋白和 pp150 蛋白具有较强的抗原性，在 HCMV 感染者的血清 中其相应的 抗体检出率较高[2～4] ，本实验室已成功构建 串连有编码 gp52 C 末端和编码 pp150 C 末端两 个基因片段的 pPIC9K-rHCMVp 表达质粒 [5] ，并在毕赤酵母获得成功表达[6] 。但该质粒缺少 纯化标记，不利于分离纯化，本研究将该质粒上人巨细胞病毒嵌合肽（rHCMVp）基因片段 导入带纯化标志 his6 的 pPICZ αA 中，重新构建、筛选了表达人巨细胞病毒嵌合肽 （rHCMVp）的基因工程酵母，并在 2 Ｌ发酵罐中，对 rHCMVp 重组毕赤酵母进行了高密度 发酵表达的研究，为大批量生产 HCMV 重组肽（rHCMVp），从而开展各种生物活性研究奠 定了基础 。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌 TOP10、含 HCMV gp52 蛋白 第 202～433 位氨基酸和 pp150 蛋白第 1006～1048 位氨基酸嵌合肽基因的重组质粒 pPIC9K-rHCMVp 由本实验室保存， 表达载体 pPICZαA 、酵母菌株 Pichia pastoris X33 为 Invitrogen 公司产品。 1.1.2 酶和试剂 各种 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶以及 Premix TaqDNA 聚合酶均购自 大 连 宝 生 物 工 程 公 司 ； DNA 胶 回 收 试 剂 盒 购 自 上 海 博 亚 生 物 工 程 有 限 公 司 ； DGL2000Marker 和 HRP 羊抗兔 IgG 购自北京鼎国公司；用于扩增的 PCR 引物由上海生物 工程技术公司合成；兔抗人巨细胞病毒血清为本实验室制备，培养基 YPDS 、YPD 、BMGY、 BMMY 均按照 Invitrogen Pichia Expression Manual 配制，YNB 为 Difco 公司产品；其余常 用试剂均为市售国产或进 口分析纯。 1.2 方法 1.2.1 重组质粒的构建 根据人巨细胞病毒嵌合肽（rHCMVp）片段的 DNA 序列和酶切位 点设计含有 EcoR I 酶切位点的引物 P1 （5’-CTGGAATTCACAGCCAATAACCGCG-3’ ）和 含 有 Sal I 酶 切 位 点 的 P2 (5’-ATAGTCGACTTCCTCCGTGTTCTTAATCT-3’) ， 从 1 pP