层析技术 修改.pptVIP

实验：氨基酸分配纸层析 层析缸 层析液 层析纸 赖 苏 脯 X 苯 分配层析原理： 不同氨基酸分配系数不同，随流动相迁移速度不同，层析后 留在不同位置。通过已知氨基酸可鉴定出待测氨基酸。 分配系数（α）= 溶质在固定相中的浓度 溶质在流动相中的浓度 溶剂系统：正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5 固定相：结合到滤纸上的水。 流动相：推动被分离组分向前移动的溶液正丁醇。 流动相依靠毛细作用向上移动。 第一章 层析技术 1.定义 2.分类 第一节 技术简介 根据交换剂的属性、层析的分离的原理可将层析分类如下： 层析技术 分配层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析 吸附层析 层析技术 纸层析 柱层析 薄层层析 离心薄层层析 高效液相层析 高效气相层析 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 3 常用术语： （1）固定相 （2）流动相 （3）洗脱体积（Ve ） 指某一成分从柱顶部洗脱开始到在底部洗脱液中出现浓度最大值时所用的洗脱液的体积。 指在层析过程中推动被分离物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析时，流动相又称为洗脱剂，即推动有效成分或杂质向一定方向移动的溶液。在薄层层析时，流动相又称为展开剂。 是由层析基质组成的，它包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液）。这些物质能与有关化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。 第二节 离子交换层析 一、技术方法过程 ②洗脱：pH梯度洗脱；或离子强度梯度洗脱 ③检测、记录分部收集。 离子交换剂 检测器 记录仪 泵入茚 三酮 分部收集 层析柱 ①上样； 不同氨基酸（蛋白质、酶、蛋白激素等）等 电点不同，在同pH条件下带电性能不同，与交换剂结合 力大小不同，结合较松的先被洗脱出来，结合较紧的后 被洗脱出来，从而被分开。 二、离子交换分离基本原理 1.分离原理 阳离子交换剂交换原理： RC-C1++C2+ RC-C2++C1+ RC- 是带负电荷的交换剂，-C1+相当于可被交换的阳离子，在层析柱子上样前-C1+假设是Na+离子，而上样后带正电荷的各种蛋白质可替代Na+而结合在交换剂上，但不同蛋白质与交换剂结合的紧密程度不同，而当用洗脱剂洗脱时，洗脱剂中的阳离子又替代交换剂上的蛋白质。不同蛋白质向下移动快慢不同，从而按照先后顺序从柱子下端随洗脱剂流出，不同蛋白质进而被分开。 2.交换剂类别 阳离子交换剂 阴离子交换剂 (1)磺酸型; (2)含苯酚的磺酸型 (3)羧酸型 二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素) 装柱： 装填均匀，松紧一致， 没有气泡，没有裂缝 第三节 离子交换层析过程中的关键技术 一、交换剂处理 二、柱子选择与装柱 三、上样要求 四、洗脱剂 五、洗脱速度 离子交换剂 阳离子离子 阳离子离子 强酸型 乙基磺酸纤维素 SE 磷酸纤维素 P 甲基磺酸纤维素 SM -O-CH2-S-O－ = = O O -O-CH2-CH2-S-O－ = = O O O -O-CH2-O-P-O－ = = O 弱酸型 羧甲基纤维素 CM -O-CH2-C-O－ = O 强碱型 弱碱型 三乙基氨 TEAE基纤维素 二乙基氨基 DEAE乙基纤维素 -O-CH2-CH2-N+-C2H5 C2H5 C2H5 -O-CH2-CH2-N+-H C2H5 C2H5 类 型 交换剂的名称 缩写 活性基团 层析柱 洗脱液 记录仪 分部收集器 核酸蛋白检测仪 检测 记录 上样洗脱 1原理：在凝胶颗粒所构成的立体的网状结构中，蛋白质的分子颗粒越大，受到凝胶颗粒的排阻越大，下行越快，优先洗脱出来；分子颗粒越小受到的排阻越小，阻力越大，洗脱出来的速度越慢。 二 凝胶过滤色谱(又称分子筛法) 凝胶 2常用凝胶： (1)天然凝胶：琼脂糖凝胶 (2)人工合成凝胶： 聚丙烯酰胺凝胶 葡聚糖凝胶 其商品名称Sephadex，根据需要可选用G-75（Mr分级范围1000-50 000），G-100（5000-100 000）等型号的凝胶。其中G后面的数据为得水值，即每g干胶吸水毫升再乘以10. 葡萄糖凝胶的规格与性质 型号 干颗粒直径(目) 分子量分级范围 得水值（ml/g） 床体积（ml/g干胶） 溶胀时间（h） 操作压