合成肽与载体蛋白的连接.pptVIP

合成肽与载体蛋白的连接 引言 合成肽可以作为半抗原，与蛋白载体连接后能有效地诱导机体产生免疫应答。 近年来合成肽在免疫学中的应用倍受重视，特别是在抗肽抗体的制备以及T细胞和B细胞表位分析中的作用。 四种方法 MBS连接法 戊二醛偶连法 EDCI法 BDB连接法 MBS连接法 MBS是目前已知的最好的异双功能交联剂，在中性PH环境，将巯基与氨基交联。 第一步反应是通过载体蛋白与MBS连接，形成MBS/KLH连结物。层析纯化后，MBS/KLH与含Cys的合成肽交联。反应过程中，合成肽Cys残基只提供巯基组，载体蛋白N-端和Lys侧链提供氨基组。 试用范围：合成肽必须具有游离的-SH，二硫键不宜用此法连接。 操作步骤： 1 、将5mgKLH溶于0.5ml PBS中，置透析袋内，于4 ℃用PBS透析过夜后，转入玻璃试管内。 2、 加入MBS/DMF70ul，室温搅拌30min。 3 、取经PB预平衡的PD-10层析柱，缓慢加样，PB洗脱，大约收集12－20管，每管0.5ml，确定收集峰（ MBS/KLH结合物）。 凝胶层析 凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。可以将样品中的大分子物质和小分子物质分开。 它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。 凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。 戊二醛偶连法 戊二醛也是异双功能偶连剂，它的两个醛基可分别与合成肽或半抗原和载体的氨基以共价键结合，将合成肽或半抗原与载体连接在一起，最好是在肽的适当部位含有Lys残基。 首先将KLH与肽结合，然后应用戊二醛法交联，以甘油封闭未参与反应的戊二醛的作用。 EDCI法 EDCI是一种化学性质很活泼的双功能试剂，其偶连反应既可在氨基部位，也可发生在羧基部位，将肽C-端羧基与载体游离的氨基，即Lys侧链连接。 因此，含有内部Asp,Glu或Lys残基的肽不宜用此法。 BDB连接法 BDB原是将肽Tyr侧链与载体蛋白Tyr侧链连接，但是通过与His，Cys和Lys侧链相互作用也可连接。如果没有这些残基，在合成肽时，可在肽的C-端或N-端加入一个Tys残基作为连接位点。 * * 载体蛋白的选择： 除应具有较好的免疫原性外，还应具有足够的反应侧链氨基酸残基，以便与合成肽连接。 连接方式的选择： 大多数连接方法依赖于游离的氨基（Lys）、巯基（Cys）、酚基（Tyr）、羧基（Asp或Glu）的存在。选择连接的方法是肽与载体通过C－或N－末端残基连接。相应于蛋白质氨基端的肽通过其羧基末端氨基酸残基连接，而相应于蛋白质羧基端的肽通过其氨基末端氨基酸的残基连接。 4 、将10mg合成肽溶于PBS中，如果合成肽不溶于 PBS，则可溶于含6mol盐酸胍的0.1mol/LPB中。 5 、将合成肽溶液与MBS/KLH结合物混合，以 0.1mol/LHCL或0.1mol/LNaOH调节至pH7.3,室温孵育3h，置4 ℃蒸馏水中透析过夜，换一次蒸馏水后继续透析大于或等于4h，连接物置于4 ℃保存供一次试验用，或－20 ℃保存备用。 第一步是肽与EDCI连接，将10mg合成肽溶于1mL双蒸水中，在磁力搅拌下加入EDCI40mg，用0.1mol/LHCl调节至pH4.5，室温反应5～10min；然后加入双蒸水溶解的KLH 10mg/0.5mL，室温作用2h后，4℃透析过夜，冰箱保存均同上。 实验所用EDCI应新鲜配置。为了避免肽聚合的形成，含有磷酸盐，碳酸盐或氨基的缓冲液因影响其反应，应避免应用。