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人BNIP3基因在Hela细胞中表达及定位 　 作者：陈登宇 刘芸 钟田雨 王蔚 赵明哲 刘靖华 姜勇 【摘要】 目的： 构建BNIP3-HA融合蛋白的真核表达载体，观察BNIP3在Hela细胞中表达及其定位。方法： 采用两步克隆法将HA和BNIP3的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上，随后转染Hela细胞。BNIP3经AlexaFluor 488免疫荧光标记，线粒体用MitoFluor Red 589染色后在荧光显微镜下观察BNIP3的表达和定位。结果： 重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR) 和测序鉴定构建正确，并在Hela细胞中能够表达，在荧光显微镜下观察，BNIP3-HA融合蛋白分布于线粒体。结论： 成功构建BNIP3-HA融合蛋白表达载体并在Hela细胞线粒体中表达。 【关键词】 基因，bcl-2； Hela细胞； 线粒体； 荧光免疫测定； 细胞内定位 ［Abstract］ Objective: To construct human BNIP3 fuse protein vector, express it in Hela cells, and determine its location in the cells. Methods: The expression vector was constructed by cloning the coding sequences of fusion protein of human BNIP3 and HA onto vector pcDNA3 by two-step method; The constructed vector was then transfected into Hela cells and observed with fluorescence microscope. The recombinant plasmid was verified by enzyme digestion, polymerase chain reaction (PCR) and sequence analysis. Results: The fusion protein was highly expressed in Hela cells. Being observed with fluorescence microscopy, the fusion protein of human BNIP3 and HA was found to distribute in the mitochondria. Conclusion: The expression vector of BNIP3 fusing to HA is successfully constructed and the fusion protein has expressed in the mitochondria of Hela cells, which would facilitate the further study of BNIP3. ［Key words］ genes,bcl-2; hela cells; mitochondria; fluoroimmunoassay; intracellular localization BNIP3作为bcl-2家族中促凋亡成员，在肿瘤的缺氧凋亡和免疫耐受的研究中有着非常重要的意义[1]。以往的研究发现，BNIP3促进细胞凋亡主要是通过线粒体凋亡途径完成的。但BNIP3的线粒体膜转位及其促细胞凋亡机制尚不清楚[1]。构建带有HA标签的BNIP3真核表达载体，并通过细胞免疫荧光技术观察了该蛋白在人Hela细胞线粒体中的定位情况，试图为探讨BNIP3蛋白在不同细胞类型中的表达和亚细胞定位，及其与线粒体内其他蛋白质的相互作用奠定基础。 1 材料和方法 1.1 主要材料 　　克隆载体pcDNA3购自Clontech公司；大肠杆菌DH5α及人Hela细胞系均为本室保存；PolyFect 转染试剂购自Qiagen公司; 小鼠HA单克隆抗体购自Cell Signaling公司；羊抗鼠IgG（H+L）AlexaFluor488、MitoFluor Red 589和DAPI细胞核染色试剂购自Molecular Probes公司；DMEM培养基购自Gibco-BRL公司; 胎牛血清（FBS） 购自HyClone 公司; 微量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自U-gene 公司; 限制性核酸内切酶Kpn I、EcoR I、Xba I、BamH I、Ligation high试剂、高保真DNA 聚合酶Kodplus和Kodplus突变试剂盒购自ToYoBo公司; 引物由北