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siRNAMed19对人肺癌A549细胞Med19转录、表达影响 　 作者：李金东 孙梅 高楠 罗树生 王荣有 金成彦 张兴义 【摘要】 目的 研究siRNAMed19对人肺癌A549细胞Med19的影响。方法 利用前期已合成的siRNAMed19慢病毒载体，感染A549细胞，并以无病毒感染组作为空白对照组，以慢病毒载体感染组作为阴性对照组。采用荧光图片和白光图片对比方法判断细胞的感染率；RTPCR法检测细胞Med19mRNA的转录水平； Western 印迹法检测细胞Med19蛋白表达水平。结果 慢病毒载体对人肺癌A549细胞的感染率在80%以上，siRNAMed19慢病毒感染组Med19mRNA转录水平明显降低，敲减效率大于70%，Med19蛋白表达量也明显降低。结论 siRNAMed19慢病毒载体可以高效感染人肺癌A549细胞，siRNAMed19对A549细胞Med19的转录和表达具有明显的抑制和消减作用。 【关键词】 siRNA；Med19；肺癌；A549细胞 肺癌的治疗效果近年仍不理想，总治愈率约10％。Med19是RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的重要组成部分，理论上阻断肿瘤细胞中Med19基因可起到治疗肿瘤的作用。迄今无关于siRNA沉默人类肺癌细胞内Med19基因诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长、转移的研究。本文观察siRNAMed19慢病毒载体对人肺癌A549细胞Med19表达的干扰作用, 探讨Med19基因在肺癌发生发展中的作用, 并为RNAi分子靶向基因治疗人非小细胞肺癌(NSCLC)提供新的实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂及材料 BCA Protein Assay Kit 购自 HyClonePierce，ECLPLUS/Kit购自Amersham公司，抗羊Med19购自Abcam公司，抗鼠IgG购自Santa Cruz公司， PCR用试剂、引物购自上海吉凯基因技术有限公司，胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司，Trizol购自Invitrogen, dNTP、MMLV逆转录酶、Rnase抑制剂购自Promega公司，oligo dT购自上海生工， A549细胞购自中科院细胞库，pcDNA3.1(-)Med19siRNAGFP、pcDNA3.1(-)Med19NCGFP慢病毒载体均来自本实验室, 滴度为4×108 TU/ml。 　　1.2 肿瘤细胞培养及传代 从液氮罐中取出人肺癌A549细胞，常规方法复苏，重悬细胞，接种至培养皿中，晃匀后置37℃、5%CO2培养箱培养。次日更换1次培养液。将生长90%汇合的细胞进行传代，连续传代20次后获得相对纯净的肿瘤细胞用于实验。 　　1.3 慢病毒载体感染人肺癌A549细胞 取对数生长期的A549细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液接种于6孔板中的3个孔，每孔细胞数约5×104。空白对照组不加入任何病毒，阴性对照组加入pcDNA3.1(-)MedNCGFP慢病毒，siRNAMed19慢病毒感染组加入pcDNA3.1(-)Med19RNAiGFP慢病毒。感染3 d后观察慢病毒报告基因——绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，用荧光显微镜观察有荧光细胞的数量来判断感染率。感染率大于50%者继续培养，待感染时间达到5 d后收集细胞抽提RNA进行RTPCR检测。 　　1.4 RTPCR检测 常规法提取总RNA，紫外分析测定RNA浓度，经逆转录获得cDNA，置于-80℃保存备用。Med19(222 kb)和βactin(214 bp)上、下游引物分别为：βactin上游5′TCGTGCGTGACATTAAGGAG3′,下游5′AAGGTAGTTTCGTGGATGCC3′和Med19上游5′GTAACTTCCTGCCTGACCTG3′,下游5′TGTGCTTGTGCTTATTCTTCTTC3′。采用标准曲线分析法（2-ΔΔCt分析法）分析每一标本的Med19mRNA的表达水平。 　　1.5 Western印迹检测 准备靶细胞及6孔板中每孔样品排列、细胞慢病毒感染操作同上。从培养箱中取出细胞，弃去培养液，PBS洗涤2次,弃去PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer，细胞刮刮下细胞，将样品转移入1.5 ml Eppendorf管中，冰上裂解细胞10～15 min,超声破碎仪破碎细胞。4℃，12 000 r/min，离心15 min。取上清，测蛋白浓度后，每个样品蛋白终浓度均调整为2 μg/μl，每个样品取相同蛋白量在10%聚丙烯凝胶条件下进行SDSPAGE。电泳后转移到NC膜上，5%脱脂牛奶TBST溶液封闭过夜后洗膜，加入1∶200稀释的羊抗Med19，TBST洗膜3次，每次10