17β-雌二醇快速舒血管效应及其内皮依赖及非内皮依赖机制.doc

17β-雌二醇快速舒血管效应及其内皮依赖及非内皮依赖机制 　 作者：王庭槐， 杨艳芳， 付晓东， 谈 智， 向秋玲， 林桂平 【摘要】 【目的】 本实验旨在观察17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)的快速舒血管效应并探讨其内皮依赖和非内皮依赖的作用机制。【方法】 采用Myodap and Myodata血管张力仪进行体外血管灌流实验，测量鼠离体胸主动脉环等长张力。【结果】 E2能浓度依赖性地快速舒张血管，浓度为10－9～10－6 mol/L时，去内皮的血管环舒张程度明显小于内皮完整的血管环，而当E2浓度增加至10－5 mol/L时，去内皮的血管环与内皮完整的血管环舒张程度无差异；在内皮完整的血管环，分别用左旋硝精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME）、亚甲蓝（methylene blue, MB）、他莫昔芬（tamoxifen）、甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin, MβCD）预孵育均能显著抑制E2（10－6 mol/L）的舒血管效应；而在去内皮的血管环，E2（10－5 mol/L）能抑制CaCl2在无钙高钾溶液中诱发的血管收缩。【结论】 E2的快速舒血管效应，具有内皮依赖性，与雌激素受体介导内皮释放一氧化氮（nitric oxide, NO）有关，且质膜微囊结构必须完整，而当E2浓度较高时主要是通过抑制细胞外的钙内流直接舒张血管，为非内皮依赖性。 【关键词】 17β-雌二醇； 血管舒张； 内皮； 质膜微囊 1 材料和方法 1.1 离体血管环的制备和张力测定 雌性SD大鼠（150～250 g），由中山大学中山医学院实验动物中心提供。SD大鼠断颈处死，迅速分离胸主动脉，放入预冷的Krebs液，去除血管上的脂肪及结缔组织，将动脉剪成2段长2 mm的血管环，置于10 mL含Krebs液的器官小室中。两根细金属丝分别由血管内腔穿过血管环，并固定于Myodap and Myodata血管张力仪（丹麦，Danish Myo Technology A/S）两端的肌动描记器装置上，将温度设定在37 ℃，持续充以95％ O2和5％ CO2的混合气体。调整血管环至适当的前负荷 (通过血管张力仪标准化步骤确定)，平衡60－90 min，期间每隔20 min更换 Krebs液一次。实验血管先用苯肾上腺素（PE ，10－6 mol/L）鉴别血管收缩活性，一些实验血管需去除内皮，采用不绣钢丝插入血管腔中轻轻滚动完成，用ACh（10－5 mol/L）检测内皮完整性，对ACh舒张大于70％认为内皮完整，舒张消失则认为内皮破坏成功。冲洗血管环再次平衡至基线水平，然后进行实验[4]。 1.2 电子显微镜 内膜完整的主动脉血管环分别用Krebs（对照）或6 mmol/L甲基-β-环糊精处理60 min，4 ℃固定过夜放在含2%戊二醛和2%多聚甲醛和蔗糖的0.1 mol/L的二甲砷酸钠盐溶液中，样本用0.1 mol/L的二甲砷酸钠盐溶液冲洗，然后再次固定于4％锇酸中1 h，样本用乙醇脱水、用环氧树脂包埋在Epon812，超薄切片用醇制的醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色，用JEOL-1010透射电子显微镜观察内膜结构。 1.3 试剂和溶液 17β-雌二醇（17-茁-estradiol, E2）、苯肾上腺素（phenylephrine, PE）、乙酰胆碱（achtylcholine, ACh）、他莫昔芬（tamoxifen）、左旋硝精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME）、亚甲蓝（methylene blue, MB）、甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin, MβCD），KCl均为美国Sigma公司产品，其他试剂为国产分析纯。E2用无水乙醇溶解后用超纯水配制；他莫昔芬用DMSO配制成10－2 mol/L的原液，实验时加入Krebs液，工作浓度为10－5 mol/L，药物剂量均以浴槽中的终浓度表示。本实验加到浴槽中的无水乙醇或DMSO终浓度最大为0.1％(v/v)，并不影响血管张力。Krebs液组成（mmol/L）：NaCl 119，KCl 4.7，NaHCO3 25，MgCl2 1，KH2PO4 1.2，Glu 11 ，CaCl2 2.5。无钙 Krebs液：CaCl2用1 mmol/L EGTA替换。在高钾去极化液中，NaCl液用相应摩尔的KCl替代。 1.4 统计分析 所有数据均以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，收缩剂诱发的最大稳定收缩幅度定为标准值100％，血管舒张的幅度以占标准值的百分比来表示。SPSS12.0统计分析软件进行组间t检验，Plt; 0.05为差异有统计学意义。