17β-雌二醇对小鼠淋巴结、脾脏及胸腺调节性T细胞及其Foxp3表达.doc

17β-雌二醇对小鼠淋巴结、脾脏及胸腺调节性T细胞及其Foxp3表达 　【摘要】 目的:研究小鼠去卵巢及体内注射17β-雌二醇（E2）后,淋巴结、脾脏和胸腺CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg细胞)及相关调节性因子Foxp3表达的变化与E2的相关性。方法:采用流式细胞仪检测CD4+ CD25+Treg细胞功能相关因子Foxp3的表达,CD4+CD25+T和CD4+CD25+highT细胞数量的变化。结果:E2抑制淋巴结中Treg细胞Foxp3的表达，上调其在脾脏和胸腺中的表达；E2下调淋巴结中CD4+CD25+ T细胞和CD4+CD25+high T细胞的比例，上调它们在脾脏尤其是胸腺中的比例。结论:E2对淋巴结、脾脏和胸腺3种免疫器官中的Treg细胞有不同的调节作用。 【关键词】 17β-雌二醇； 调节性T细胞； Foxp3 CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg 细胞)在自身耐受的维持中发挥重要作用，具有免疫无能和免疫抑制两大特点，目前在自身免疫性疾病、器官移植、肿瘤免疫、慢性感染性疾病等方面的研究都广泛涉及Treg细胞免疫调节的问题［1］。Treg细胞可以通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身免疫T细胞的活化,维持自身免疫耐受,防止自身免疫性疾病的发生［2］。 17β-雌二醇(E2)与自身免疫性疾病的发生发展密切相关，如系统性红斑狼疮（SLE）［3-4］。临床研究发现，孕期伴随E2水平升高，SLE病人发病趋向缓解或者不受影响［5］，也有研究报道孕期SLE病情加重［6］。有研究表明，SLE患者经激素治疗后高表达CD25的CD4+CD25+T细胞，也就是具有免疫抑制作用的CD4+CD25+high T细胞较治疗前和对照组明显升高［7］。但是在E2作用下，不同免疫器官中Treg细胞的变化及其对免疫调节的作用机制还未明确。因此，本文作者拟通过检测E2处理后小鼠淋巴结、脾脏和胸腺中Treg细胞的数量及其功能，为进一步探讨其在SLE病程中的作用提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 4～6 周龄雌性C57L/B6J 小鼠,购自南京大学模式动物研究所。实验前动物在房内至少饲养1 周,均用颗粒饲料喂养在(21±2)℃的环境中,使其自由摄食和饮水,实行12 h 的白天和黑夜循环。 1.1.2 试剂 E2、胶原酶D和小鼠红细胞裂解液均购自美国Sigma公司； Mouse Regulatory T Cell Staining Kit (PE Foxp3,FITC CD4,APC CD25)购自美国Ebioscience公司。 1.2 方法 1.2.1 雌激素处理小鼠 4～6周 C57L/B6J雌性小鼠分为4组，每组7～8只：对照组（Control组）；假手术组（Sham组）；去卵巢组（Ovx组）；E2处理组（E2组），小鼠去卵巢手术后1周，腹腔注射E2直到第10天，E2剂量为100 μg·kg-1·d-1。 1.2.2 流式细胞术检测各处理组小鼠胸腺、脾脏和淋巴结的Treg细胞 脱颈椎处死小鼠后分别取小鼠胸腺，脾脏以及颌下、腋下、腹股沟和肠系膜淋巴结，用镊子拉碎；1 mg·ml-1的胶原酶D 37 ℃消化30 min，200目筛网过滤，4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min，洗涤除去多余胶原酶；小鼠红细胞裂解液裂解脾脏红细胞2 min后，4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min，去除脾脏红细胞。分别得到小鼠胸腺、脾脏和淋巴结细胞后，每个样本准备106个细胞，荧光单克隆抗体FITC-CD4 0.125 μg/test和APC-CD25 0.06 μg/test标记细胞表面CD4/CD25，4 ℃避光孵育30 min；PBS洗1次，4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min；弃上清后1 ml固定破膜剂重悬细胞，4 ℃避光孵育过夜；PBS洗1次；破膜剂洗2次；CD16/32 1～2 μg/test封闭Fc受体，4 ℃，15 min；0.5 μg/test荧光单克隆抗体PE-Foxp3标记胞内Foxp3，4 ℃避光孵育30 min，同时用PE Rat IgG2a 同型抗体作为对照，4 ℃避光孵育30 min；破膜剂洗2次，400 μl PBS重悬，上流式细胞仪检测。以淋巴细胞群设门，CellQuest 软件分析CD4/Foxp3荧光双阳性细胞占CD4+ T细胞的百分比，CD4/CD25双阳性细胞占CD4+T细胞的百分比以及CD25高表达细胞占CD25/CD4阳性细胞的百分比。 1.3 统计学处理 所有实验数据以平均值±标准差表示,统计分析采用t检验,以Plt;0.05 为差异有统计