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PCR 技术在植物病理研究中的应用 1 2 赵艳琴 ，黄云 ，曾富春，马淑青 （四川农业大学农学院，雅安，625014） Email：Zhaoyanqin782828@ 摘 要：本文阐述了 PCR 技术在植物病理学的研究中的应用，尽管 PCR 技术在许多领域都有 很广泛的应用，但在植物病理学上的应用只是在近几年才开始，并且取得了非常好的效果。 本文分别从 PCR 的基本原理，在真菌病害，细菌病害，病毒病害和植原体病害几个方面综述 了PCR 技术在植物病理研究中的应用现状及发展前景。 关键词：PCR 扩增；植物病理；随机扩增 1引言 植物病害的检测方法很多，传统的病原学检测方法通常是通过肉眼或借助显微镜查找病 原体、观察其形态，以确定病害的类型[1]。随着科学技术的发展，许多新的技术方法不断引 入该领域。但由于植物病害的病原体株系多、血清类型多，漏检问题难以避免，而且血清学 反应的特异性迄今仍不甚满意[2]。PCR及其相关技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应 用于植物病害的检测研究。植物病害的多样性及复杂性已使常规的PCR技术较难满足需要， 加之PCR技术本身的快速发展，给植物病害病原体的检测提供了更多可供选择的方法，如： 反转录聚合酶链式反应、免疫捕捉PCR、PCR-单链构型多态性、实时荧光PCR、随机扩增多态 性DNA和限制性片段长度多态性等[2]。 2 关于 PCR 扩增技术 2.1 PCR 技术的基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)是Mullis Kerry B ．1985 年首创的 1 项DNA体外扩增技术，这项技术提供了体外目标DNA片段拷贝数呈指数级(2n，n －循环次 数)增长的巧妙方法[3] 。这一技术要比传统的DNA克隆技术更为方便。利用PCR技术能够从 复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的序列，使某一DNA片段得到特异性的扩增。 PCR 技术的 3 个基本步骤包括：(1)靶 DNA 变性；(2)两个寡聚核苷酸引物退火至变性 的DNA 链上；(3)通过耐热 DNA 聚合酶使引物得以延伸。新合成的 DNA 链作为后来 DNA 合成的靶，按前述的几个步骤重复 40-50 次。此方法的专一性来源于合成的寡聚核甘酸引物， 它的碱基对被限定在靶序列的 3 ˊ端从而被扩增。PCR 反应液的基本组成是模板DNA 分子、 水、缓冲液、盐、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、引物和耐热 DNA 聚合酶。尽管其组成简单， 但 PCR 反应本身的动力学和物理化学相当复杂而不易理解，多数研究着重于 PCR 技术的应 用。 PCR反应中的引物的设计应遵循如下原则：(1)一对引物要有近似的解链温度；(2)引物 序列内不能出现回文结构；(3)引物的 3 ˊ端不能存在互补性以避免引物自身的缔合；(4)应 1 避免引物的 3 ˊ端存在高含量的G+C，碱基分配尽可能随机，否则易在模板DNA富含G+C 的 区域发生错配。上述原则是针对长序列引物而言的，对长度仅为 9-l0 个核苷酸的引物，除 了引物内不能有反向重复序列外，其突出的特点还表现在G+C含量应高于 50 ％，引物的 3 ˊ端为G或C时可取得较高的特异性[7] 。 目前常用的DNA聚合酶是分离自水生嗜热杆菌(Thermas oquaticus) 的耐热性DNA聚合 酶，称为Taq DNA聚合酶，它的发现和应用极大地促进了DNA片段的特异性扩增。Taq DNA 聚合酶因模板DNA不同，其最适温度高达 75-80℃，95℃条件下半寿期可达 40min[8] 。自然 界存在丰富的有待于开发利用的DNA聚合酶资源，比如从高温嗜酸性的古细菌酸热硫化叶 菌分离到的DNA聚合酶能耐受 100℃变性条件的PCR反应，这种特性有助于提高PCR扩增反 应的特异性