AAV病毒载体应中的常见问题-重组 AAV 病毒的滴度测定.pdfVIP

本元正阳基因技术股份有限公司 国家高技术计划病毒基因载体研发基地 重组 AAV 病毒的滴度测定 目录 一、重组病毒滴度表示形式 二、点杂交方法测定重组 AAV 病毒滴度 原理 材料和方法 三、用蛋白浓度推算重组 AAV 病毒滴度 一、重组病毒滴度表示形式 重组病毒的滴度有多种表示形式，如 cfu/ml,pfu/ml, ,IU/ml, TU/ml, particles/ml，v.g/ml, DRP/ml 等。这些滴度表示形式的不同主要是由于各种病毒载体的生物学特点不同，以及约定俗 成的习惯造成的。为了便于比较，目前国际上越来越倾向于采用物理滴度(如 particles/ml， v.g/ml, DRP/ml 等)表示重组病毒的滴度。 cfu: clone forming unit 的缩写，克隆形成单位。cfu/ml 指 1ml 重组病毒液感染细胞能形成转 导细胞克隆的数量。多用于反转录病毒载体如 LN 系列。由于该载体中有 neo 基因表达单位，用 获得的重组病毒感染细胞后，可用 G418 来选择培养，通过计数 G418 抗性克隆数量来表示病毒滴 度。用反转录病毒载体感染细胞不会引起细胞裂解性病变，所以不用 pfu （plaque forming unit） 来表示滴度。 pfu：plaque forming unit 的缩写，空斑形成单位。多用于腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、 痘病毒载体等引起细胞裂解性病变的病毒载体。 IU：infection unit 的缩写。感染单位。 TU：transduction unit 的缩写。转导单位。 Particles/ml：每 ml 液体中含有的病毒颗粒数。也叫物理滴度。其中的病毒颗粒有可能是 实心的，也有可能是缺损的或空心的。后者对转染是无效的。为了更好地表示有效滴度，有些病 毒载体滴度在应用时采用了含有基因组的病毒颗粒的概念，从而将缺损的或空心的病毒颗粒排除 在滴度之外。 DRP/ml: DNase resistant particles/ml 的缩写。见用于表示AAV 病毒载体滴度。指每 ml 病毒液中含有能抵抗 DNaseI 消化的病毒颗粒数。主要用于排除病毒颗粒外的基因组 DNA，即未 被包入病毒粒子中的基因组 DNA 对滴度的影响。通常用点杂交（dot-blotting）方法来测定。 地址：北京经济技术开发区永昌中路 6 号 1 邮政编码：100176 电话：010 传真：010 网址： 本元正阳基因技术股份有限公司 国家高技术计划病毒基因载体研发基地 v.g./ml：vector genomes/ml 的缩写。常用于表示 AAV 病毒载体的滴度。是指每ml 病毒液 中含有的基因组拷贝数。通常用点杂交（dot-blotting）方法、QC-PCR 方法、real time-PCR 方法来测定。通常在测定前对样品用 DNaseI 处理，因此该滴度表示方法一般指每ml 病毒液的病 毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。 二、点杂交方法测定重组 AAV 病毒滴度 以下介绍本公司测定重组 AAV2 病毒 （recombinant adeno-associated virus, rAAV2）的 点杂交方法。 探针 由于目前本公司构建的各种重组AAV 病毒大多采用 CMV 启动子，因此采用 CMV 启动子序列 合成探针具有很好的通用性，即凡是含有 CMV 启动子的重组 AAV 病毒都可以用该探针测定病毒 滴度。 下图为重组 AAV 病毒基因组结构示意图。 ITR CMV Transgene ITR 在这里我们列举了采用 CMV 启动子 DNA 为模板合成探针，通过点杂交方法检测病毒颗粒中 CMV 启动子的拷贝数来计算重组 AAV 病毒的滴度。如果重组 AAV 病毒中采用的是其它启动子，就 不能用所述的 CMV 探针做点杂交。事实上，研究者可采用被包装的治疗基因序列为模板，