原位杂交检测cyclinE在皮肤血管瘤组织中表达.docVIP

原位杂交检测cyclinE在皮肤血管瘤组织中表达 　【摘要】 目的: 探讨细胞周期素E（cyclin E）在皮肤血管瘤组织中的表达及临床意义。方法: 采用原位杂交方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织血管内皮细胞的cyclinEmRNA表达水平， 利用图像分析技术检测不同时期血管瘤和正常皮肤组织的阳性面积率和平均光密度。结果: 增生期血管瘤内皮细胞cyclin EmRNA表达水平明显高于退化期及正常皮肤组织，差异有显著性意义（ P lt;0.01）;退化期与正常皮肤组织血管内皮细胞cyclinEmRNA表达水平差异无显著性意义（ P gt;0.05）。结论: 细胞周期素E在血管瘤的发生中起了重要的作用。 【关键词】 原位杂交; 血管瘤; 细胞周期素E; 阳性面积率; 平均光密度 　　血管瘤是婴幼儿中发病率最高的一种以内皮细胞异常增殖为组织学特征的肿瘤。新生儿患病率为1.1%～3.8%，至1岁时可高达10%。目前成人病例也呈逐渐上升趋势。虽然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤可持续发展或其生长部位特殊而具有一定的危险性，如果位于颜面、颅内及口腔可引起明显的畸形及功能障碍，如持续发展可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症。临床治疗尤其对于大面积血管瘤的治疗尚缺乏确切、迅速有效的方法。虽然血管瘤各期的组织形态学特征已经通过免疫组织化学方法鉴定出来，但其发病机制尚不清楚，因此，也难以寻找到一种有效的治疗手段。细胞周期素E （cyclin E）是细胞周期重要的调节因子，cyclinE与特定的细胞周期依赖性激酶（cyclin depen-dentkinases，CDKs）构成复合体，可以使底物磷酸化，启动DNA 的合成， CDK 抑制蛋白（ cyclin-dependent kinase inhibi-tor proteins ，CKIs） 能够抑制cyclinE的活性。不同的物质可以通过与CKIs之间直接或间接的相互作用影响cyclinE的表达，这些相互作用对阐明肿瘤发生的机制是非常重要的，而且可以为大量常见的肿瘤提供预后的信息。我们采用原位杂交方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织血管内皮细胞的cyclinEmRNA表达水平， 并利用图像分析技术检测不同时期血管瘤和正常皮肤组织的阳性面积率和平均光密度，探讨细胞周期调节因子cyclinE在血管瘤发生中的作用。 　　1材料 　　1.1材料来源收集武汉大学人民医院病理科2002～ 2005 年皮肤血管瘤存档蜡块50 例， 其中男性26例，女性24例， 年龄2月～18岁。血管瘤位于头皮、眼睑、耳部、颈部、胸部、上臂、手部及大腿等部位。患者术前均未做任何辅助性治疗。 　　1.2材料分组蜡块切片厚5um，常规HE染色和原位杂交方法检测血管瘤组织中cyclinEmRNA的表达。按Mulliken分类标准将切片分组， 其中增生期血管瘤24例， 退化期血管瘤26例。另取瘤组织周围正常皮肤5例作为对照。 　　 　　2实验方法 　　2.1常规HE染色 　　2.2原位杂交①常规脱蜡至水。用3%H2 O2 室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶。②用2滴细胞打孔液将组织切片浸泡10～40min，0.1M PBS室温5min洗3次，用无RNA酶 处理过的滤纸吸干。③暴露mRNA核酸片段:切片上滴1滴复合消化液，37℃消化5～20min。④0.5M PBS洗3次×5min。蒸馏水洗1次，用无RNA酶处理过的滤纸吸干。⑤预杂交:干的杂交盒底部，加5～10ml蒸馏水。每张切片加20ul（或1滴）预杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，置于4℃杂交过夜。用2×SSC洗涤5min×3次，用无RNA酶处理过的滤纸吸干。⑥杂交:干的杂交盒底部，加5～10ml蒸馏水。每张切片加10～20ul（或1滴）含寡核苷酸探针的原位杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱37℃ 杂交4～5h。⑦杂交后洗涤:揭掉盖玻片，30～37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×3 次。用无RNA酶处理过的滤纸吸干。⑧滴加 SA-HRP:37℃20min或20℃左右30min。0.5MPBS洗5min×4次，用无RNA酶 处理过的滤纸吸干。⑨DAB显色:滴加1滴预先配制混匀的DAB显色试剂至标本上，显色5～15分钟。⑩酒精脱水，二甲苯透明，封片。 　　2.3图像分析处理将血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织的切片置O-LYMPUS显微镜下（400×），对所测视野进行准确定位后由摄像系统提取数值化细胞图像输入HPIAS-1000多媒体彩色病理图像分析系统（同济千屏影像公司）进行处理，每例随机选取5个完整而不重叠的视野进行定量分析，测定免疫组化反应阳性颗粒的平均光密度和面积的百分率，