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分子标记技术在中药分类及资源保护中应用进展 　 作者：郭宝林 刘万水 陈玉婷 朱曼萍 王丹红 王建辉 【关键词】 分子标记技术 中药分类 资源保护 　　分子标记技术一般是指研究核酸及蛋白质等携带遗传信息的大分子特征的技术，分子标记可分为DNA分子标记和蛋白质分子标记。分子标记技术引入中药领域后被广泛地应用于分类、鉴别和保护等各个层面，受到越来越多的重视。本文将重点介绍在中药分类和资源保护方面的应用。 　　1 DNA分子标记 　　DNA分子标记是随着核酸分子技术的发展而发展起来的,已被应用于生命科学的各个领域，特别是在系统进化、保育遗传学、品种鉴定及良种选育、遗传图谱构建、基因定位等方面得到了广泛应用。根据DNA 分子标记所采用的核心技术大体上可分为三类：一是以分子杂交为基础的DNA指纹技术；二是以PCR为基础的DNA指纹技术；三是DNA序列标记技术。 　　1.1 基于分子杂交的DNA指纹技术基于分子杂交的DNA指纹技术可分为RFLP,SSR等技术，这些技术的实验过程一般要包括限制性酶切、Southern印记、探针标记、分子杂交等繁琐的实验步骤，且只能检测出探针长度范围内切酶识别位点的变异，多态性检出效率低，同时要求的DNA量比较大，因而限制了其在实际中的应用。本类技术在植物系统与进化研究中有很多成功的例子，但在中药领域目前应用得较少，这里不做重点介绍。 　　1.2 基于PCR基础的DNA指纹技术基于PCR的指纹技术近年来层出不穷，它们各有其优缺点和适用范围。这里根据各技术在中药领域中应用的潜力及普遍性等方面重点介绍以下几种：随机扩增长度多态性DNA（RAPD）、基于PCR的简单重复序列（PCR-SSR）、扩增片段长度多态性（AFLP）、基于PCR的限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、直接扩展增长度多态性（DALP）。 　　1.2.1 RAPDRAPD是以10碱基的任意序列寡核苷酸片段为引物，在未知序列基因组DNA上进行随机扩增以研究样本间遗传差异的指纹技术，是当今在中药研究领域中应用的最广的分子标记技术，如分类和遗传关系分析、遗传多样性评价、资源保护等，起到了非常重要的作用。 　　遗传关系分析：RAPD分析和等位酶标记都被广泛地用来研究物种的遗传多样性，但能检测到比等位酶高的多样性信息。邵爱娟等［1］利用RAPD对栽培人参不同品系之间的遗传多样性进行研究，从分子水平证明了根据表征性状对人参栽培类群进行划分是可行的。郭宝林等［2］利用RAPD技术探讨了中药厚朴种内关系和道地性问题，并将所得结果与形态学及指标成分相联系，最终认为厚朴应分为3个地理综，道地性主要来源于遗传变异。方芳等［3］在进行浙江产香茶菜属植物8个类群的RAPD分析时发现，各类群存在明显的分化，同属不同组的大萼香茶菜与香茶菜的遗传关系很接近，甚至小于同组的香茶菜与显脉香茶菜之间的遗传距离。郑喜珍等［4］在研究中、韩牛膝类药材的遗传关系时发现，RAPD聚类图很好地区别了牛膝与土牛膝，而韩国产牛膝则与怀牛膝差别不大，支持了《中国植物志》对二者的处理，并建议《韩国药典》予以更正。任如冰等［5］利用RAPD技术来评价苍术居群间的亲缘关系，结合前人对苍术精油成分的聚类分析，将10个居群划分为3个类群，并支持了将北苍术作为变种处理的观点，从而为道地药材的引种栽培提供了分子水平上的依据。 　　遗传多样性和资源保护：宋卫华等［6］利用RAPD对三峡库区稀有药用植物裸芸香进行遗传多样性的研究时发现各居群间已有较大的分化，居群内遗传水平较低，但总体上仍有较高的多样性，并根据各居群地理隔离程度大、基因流较小且处在库区消涨带上的实际情况，给出了保育建议以促进种群的恢复［7，8］。利用RAPD技术对珍稀濒危药用植物金铁锁多和丽江山慈姑态性进行DNA 指纹检测时，发现尽管各居群内遗传多样性较为丰富，但居群间分化较大［7，8］，在进行种质资源保护时，应该对居群内与居群间给予同等重视。 　　1.2.2 PCR-SSR 微卫星DNA（SSR）是短的、串联的简单重复序列，组成基元是1～6核苷酸，广泛存在于真核细胞的基因组中。由于串联重复的数目是可变的且呈现出高度的多态性，以及在单个微卫星位点上可做共显性的等位基因分析，微卫星序列作为比较理想的分子标记广泛用于遗传图谱的构建、居群遗传学和系统发育研究。PCR-SSR目前一般常用的技术有微卫星引动的PCR（MP-PCR，利用SSR单引物扩增）及锚定PCR-SSR、微卫星位点的PCR扩增（SSLP），ISSR（扩增重复位点之间的区域）等几类，前几种方法在中药领域应用的较少，这里重点介绍应用最为广泛ISSR。 　　1.2.3 ISSR是由Zietkiewicz 等［9］发明的利用重复锚定引物扩增SSR之间的片段，且一套引物可以在多种植物中通用，是一种非