蛋白质分离纯化的步骤.docVIP

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。 卵清蛋白分离提取及纯化的具体试验步骤一、实验目的与原理 鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。 由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。 二、材料与试剂： 1．材料：新鲜鸡蛋2只 2：仪器：抽滤瓶500－1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3：试剂： 10％TCA，用固体NaOH调调PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 三、操作步骤 1，取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25－30，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5，再继续搅拌30min，然后在4冰箱中放置过夜。 2,次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。 3，边搅拌边加入4预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min，收集沉淀。 4，将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min ,去除不溶物。抗菌蛋白步骤准备试剂：异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。 操作步骤： 1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～812000×g离心10分钟弃上清。 2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2～87500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。 3.真空抽干蛋白质沉淀5～10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50温浴使其完全溶解，不溶物2～810000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20保存备用。 注意事项： 1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M