耐酒精酵母的筛选.docVIP

摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。 关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定 前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了生产成本。因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的进行，并且有了可喜的成果【2】。耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。酒精成本的降低，使得酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用，减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。对我国经济的可持续发展有着深远的影响。在查阅了大量文献资料的前提下，本文拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。 实验部分： 1材料与试验方法： 1.1材料： 1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。 1.1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。 1.1.3培养基： 1.1.3.1富集培养基：葡萄糖50 g,KH2PO4 2.5 g,Na2HPO4 0.5 g,(NH4)2SO4 1 g，尿素1 g,MgSO·47H2O 0.5 g，酵母膏0.5 g,FeSO4 0.1 g，孟加拉红（1%水溶液）3.3 mL，水定容至1000 mL。若配制液体培养基，将其pH调至4.5；若配制固体培养基，则加琼脂15 g，然后调pH至5.5～6。在112℃下灭菌30 min【3】。 1.1.3.2分离培养基： YPD(葡萄糖30g、蛋白胨15g、酵母膏15g)培养基【4】。 1.1.3.3初筛培养基：即TIC显色培养基。上层培养基为TTC 0.5 g，葡萄糖5 g，琼脂15 g，水1000 mL，自然pH[7]；下层培养基为葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母膏1.5 g，KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O0.4 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH值5.5～5.7【4】。 复筛培养基：葡萄糖30％，酵母膏0．5％，蛋白胨0．5％，氯化铵0．15％，磷酸氢二钾0．15％，硫酸镁0．1％，氯化钙0．28％，0．06MPa灭菌15min【4】。 发酵培养基：玉米淀粉适度糖化后添加部分营养元素。 1.1.4实验仪器：高压灭菌锅；恒温培养箱；摇床；超净工作台；干热灭菌箱；全套接种工具；培养所用的玻璃器具。 1.1.5酶制剂：淀粉酶；糖化酶。 1.2试验方法： 1.2.1菌种的富集培养： 富集培养法可以创造一些条件只让所需微生物生长，在这些条件下，所需的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的最适条件包括选择最适的碳源、能源、温度、pH等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在培养基上长出单菌落【5】。 将配制好的富集培养基装入用干热灭菌箱灭菌后的三角瓶中，用高压灭菌锅进