用于高通量测序的基因组靶序列捕获方法建立establishment-生物通.pdf

HEREDITAS (Beijing) 2010 年 ISSN 0253-9772 用于高通量测序的基因组靶序列捕获方法建立  1,2 2 2 3 4 2 2 2 陈丹 ，张雯 ，朱智东 ，黄银 ，王平 ，周贝贝 ，杨晓楠 ，肖华胜 ，张 庆华 1,2 1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院，医学基因组学国家重点实验室，上海 200025 ；  2. 生物芯片上海国家工程研究中心，上海 201203 ；  3. 国家人类基因组南方研究中心，上海 201203 ；   4. 上海交通大学医学院基础医学院病理教研室, 上海 200025  摘要：文章旨在建立一种基因组目标靶序列捕捉文库的方法，并结合第二代测序技术，以实现候选基因区 段的深度测序。利用 Agilent 公司的 eArray 在线平台，对 1 250 个基因的 11 824 个外显子共 2 414 977 bp 的 基因组序列进行 120 个碱基长度的捕捉探针(钓饵)设计，并制备成 SureSelect 液相靶序列捕获试剂。选用 2 例人基因组 DNA ，超声打断后末端补平并磷酸化，连接 SOLiD 接头，回收 150bp~200bp 的DNA 片段，与 靶序列探针杂交捕获目标序列，油包水微乳滴 PCR 扩增后，磁珠分离富集，上 SOLiD 测序系统通过工作 流程分析（WFA ）进行文库质量的评价，或正式测序反应。结果显示对所包含的 11 147 个基因外显子片段 设计出并合成了 46 509 个捕捉探针，制备成 SureSelect 试剂盒。探针可有效地捕捉并富集基因组 DNA 的 目标靶片段，定量PCR 显示富集效率可达 29 倍。WFA 分析表明文库可以在 SOLiD 仪器进行正式测序。测 序结果显示靶序列区域的测序数占有效总测序数的比例达到 70%，覆盖率均在200× 以上。结果表明本研究 所建立的 SureSelect 基因组靶序列捕捉、富集建立测序文库的技术路线可行，可直接用于 SOLiD 测序仪的 测序。 关键词：靶序列捕获；第二代测序；液相杂交；油包水 PCR  Establishment of Target Genomic DNA Capturing System for Next Generation Sequencing 1,2 2 2 3 4 CHEN Dan , ZHANG Wen , ZHU Zhi-Dong , Huang Yin , Wang Ping , ZHOU Bei-Bei2 2 2 1,2 , YANG Xiao-Nan , XIAO Hua-Sheng , ZHANG Qing-Hua 1． State Key Laboratory of Medical Genomics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China; 2 ． National Engineering Research Center for Biochip at Shanghai, Shanghai 201203, China; 3. Chinese National Human Genome Center at Shanghai, Shanghai 201203, China; 4.  Department of Pathology, College of Basic Medical Science, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China   ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐  收稿日期：2010