细胞培养技术总结-重要.docVIP

细胞培养及检测相关技术小结 细胞培养基配制 以1000ml培养基为例。 1000ml成骨细胞培养基 = 850mlα－MEM培养液 + 150 ml 特级胎牛血清FBS (15%) (1). α－MEM powder: 10.2 g/L ~~~ 8.67 g for 850 ml (2). NaHCO3: 2.2 g/L ~~~ 1.87 g for 850 ml (3). Twice distilled water 850 ml, dissolve the powder in water (4). FBS (15%,v/v) 150 ml (5). Filter to sterilized bottle (6). Label the bottle and store in 4℃. Notes: 4,5 should be operated in the sterile working place. And if necessary, we can add some antibiotics into the medium（usually in primary cell culture）. PBS（10×） NaCl: 80g/L KCl: 2g/L Na2HPO4: 14.4 g/L KH2PO4: 2.4 g/L PH=7.4, with HCl or NaOH Too much PO42-is harmful to cell, so only very little amount is necessary. Get some certain to dilute this 10 times concentration PBS when we need. 三、胰蛋白酶Trypsin- EDTA 消化液(10×) This solution is used for cell released from the culture flask。 The final concentration of EDTA is 0.05%; The final concentration of Trypsin is 0.53 mmol/L. Take 40 ml solution for example (10×) (1). Trypsin: 40ml×0.05%×10 =0.02g (2). EDTA: 40ml×0.53×10-3×376(molecular weight)×10-3×10 =0.0797g (3). PBS 40 ml (4). Filter and distribute it into 2 ml sterilized tubes. 四、细胞冻存液 细胞冻存液是DMSO（二甲基亚砜）和FBS的混合液，DMSO与FBS的体积比为1：2，混合均匀后过滤，加0.5ml混合液入灭菌过的冻存管，放进-20℃冰箱中备用。 五、传代 细胞买来时，多为老细胞，细胞活性不强，因此，需要先传代以恢复其活性。细胞刚买来时，培养瓶里面一般都装满了培养基，在操作时，需要先将培养基移出至干净灭菌的管子备用。 取光镜观察已长满细胞的培养瓶（下面按一瓶计算加入液体量），进行消化： 吸取19ml PBS（需用小滤膜过滤去除细菌等） 弃去旧培养基 用5ml PBS 晃洗培养瓶，弃去PBS，并重复一次。 在剩余的9ml PBS中加入1ml的trypsin+EDTA 消化液（消化液为10倍于正常浓度）。过滤后加入培养瓶中。如果细胞贴壁不牢，只需要加一次，2ml；如果细胞贴壁牢固，第一次可加入3~5ml，水平晃动几秒后弃去，再加入2ml消化液，晃动并轻弹培养瓶底，同时在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞被完全消化下来时，加入10ml细胞培养液，并将细胞液移至离心管。 离心，1200rev/min，5min。弃去上清液，晃动离心管使细胞分散，加入培养基10ml，用两个培养瓶分装细胞液； 标记后半旋开瓶盖放入孵化箱进行培养。 Notes： 1. 细胞不能长时间处于无液体状态，因此在每个步骤之间，应该作好准备工作，如在步骤1.c)和1.d)之间，应该先准备消化液，再弃去第二次的PBS清洗液。 2. 通常情况下，成骨细胞的贴壁力较强，因此可以弃去第一次的消化液，再加入第二次；反之，如遇到贴壁力较弱细胞，加入一次消化液肉眼可见细胞明显脱落，则只需加入这一次消化液。 3. 在显微镜下观察细胞脱壁情况时，细胞呈圆形并聚集成团，水平晃动培养瓶时，细胞跟随瓶子晃动，在此，要确认细胞完全从瓶壁上消化下来。 4. 在分散离心后的细胞时，要确认细胞分散均匀，因为成团的细胞不利于细胞生长，并且对LDH等实验结果影响较大。 六、换液 传代后，细胞生长每两天就