第5章沉淀技术200506.docVIP

沉淀技术 知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。 重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。 难点：常用沉淀方法的灵活运用。 一、沉淀技术概述： 在生物医药工业和中药现代化行业，作为传统初级分离手段的沉淀技术是指因理化因素的改变引起生化活性物质的溶解度降低，导致固体成相的现象。与结晶的规则晶体相比，沉淀是无定形的固体颗粒，组成成分复杂，其纯度远低于晶体。 目前，沉淀技术广泛应用于实验室和工业规模蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子物质和黄酮、生物碱、皂甙等生物小分子物质的回收、浓缩和纯化。 沉淀技术可以分为：盐析法、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、等电点沉淀、非离子型聚合物沉淀、聚电解质沉淀和高价金属离子沉淀法等。本节将以蛋白质沉淀为例，介绍沉淀技术的原理、各种沉淀方法的特点与选择原则。在介绍沉淀技术之前，首先对目标蛋白质的理化性质做一个简单的回顾。 蛋白质按功能可分为活性蛋白与非活性蛋白，活性蛋白有：酶、激素蛋白、运输和贮存蛋白、运动蛋白、防御蛋白、病毒衣壳蛋白、受体蛋白、毒蛋白和控制生长与分化的蛋白等；非活性蛋白如：胶原蛋白，角蛋白等。通常，大部分蛋白质可溶于稀盐、稀酸、稀碱和水中，蛋白质在不同溶剂中的溶解度差异主要取决于其自身分子结构性质（如亲疏平衡值各不相同的氨基酸组成等内因）和溶剂的理化性质（如温度、pH值和离子强度等外因）。因而，可用不同的溶剂或缓冲液提取、分离、纯化蛋白质和酶。 凡质点大小在1-100 nm范围内所构成的分散系统称为胶体。蛋白质分子的直径一般在2-20 nm范围内，且蛋白质分子表面分布着与水分子结合的亲水氨基酸的极性R基。因此，天然蛋白质溶液得以保持稳定的亲水胶体性质，其稳定性取决于：水化作用（水化膜的存在，能防止蛋白质分子相互碰撞而聚集）和电荷的排斥作用（两性解离，同性电荷相互排斥而使蛋白质无法聚集）。当改变蛋白质的质点大小，电荷情况和水化作用的强弱，将破坏蛋白质的稳定性，蛋白质就从溶液中沉淀出来，这就是蛋白质的沉淀作用。因此，在生物大分子的分离纯化中，常利用蛋白质的沉淀作用来分离和制备蛋白质和酶。如：采用盐析法从鸡蛋壳中提取溶菌酶和采用乙醇分级沉淀血浆蛋白。 由于蛋白质是两性生物大分子电解质，在水溶液中，蛋白质表面存在不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区。蛋白质和氨基酸一样，既含有酸性的基团又含有碱性的基团，在特定的pH范围内能解离产生带正电荷或带负电荷的基团。对于某一特定蛋白质而言，当在某一pH时，其所带电荷正负相等（即静电荷为0），这一pH值被称为蛋白质的等电点（PI）。蛋白质处于等电点时，其电导率、渗透压，粘度及溶解度等性质均处于最低值，因此，通常利用蛋白质的两性解离和等电点特性来沉淀蛋白质。如：牛奶酪蛋白的等电点沉淀。 当天然蛋白质受到某些物理因素（加热、紫外线、X射线和超声波处理等）和化学因素（强酸、强碱、尿素、乙醇和TCA等）的影响后，由于氢键、盐键等次极键维系的高极结构遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使其生物学性质，物理化学性质改变。这种现象称为蛋白质的变性作用。变性蛋白质的理化性质均发生改变，最显著的是溶解度降低、粘度增大、分子扩散速度增大、渗透压降低、等电点改变、生物活性降低或丧失和易被酶水解等。因此，在制备酶制剂或生物活性物质时应防止蛋白质变性的发生。但蛋白质的变性作用可用于选择性变性沉淀中去除杂质。如：从啤酒酵母泥中提取醇脱氢酶就是采用选择性热变性沉淀的方法去除杂蛋白。 综上所述，由于蛋白质周围的水化层和蛋白质分子间的静电排斥作用是防止蛋白质沉淀的两种屏障。因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（ξ电位） 图1 碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图[B3] （pH 6.6，25℃，S0=17 g/L） S（g/L）-碳氧血红蛋白浓度；r/2-离子强度=1/2∑miz2；mi-溶液中离子的摩尔浓度；z-离子所带电荷数。β-常数，即截距，代表理想状态时纯水中碳氧血红蛋白浓度的对数；Ks-盐析常数，曲线的斜率。 因此，可以把盐析机理归纳为如下三点：①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白质表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。盐析沉淀的机理示意于图2。 图2 盐析机理示意图[B3] 由于盐析现象还不能很好地从理论上进行解释，现在常用Cohn方程式logS=β-KsI说明。式中：S（g/L）-蛋白质的溶解度；I-离子强度=1/2∑miz2；β-常数，与盐的种类无关，但与温