猪血超氧化物歧化酶联合提取及其活性检测研究1.docVIP

猪血超氧化物歧化酶联合提取及其活性检测研究 　[目的]研究猪血超氧化物歧化酶(SOD)与其他生物活性物质的联合提取工艺,为充分利用猪血资源和规模化生产SOD提供技 术基础。 [方法]从猪血中分离纤维连接蛋白、免疫球蛋白和血红素后,提取SOD。通过优化邻苯三酚的用量、SOD样液用量、反应温度 和缓冲液pH值,对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的条件进行了优化。按照优化后的条件测定联合提取的SOD的比活力。[结果] SOD活性测定的优化条件为50mmol/L邻苯三酚7μ,l 50mmol/LTris-HCl(pH 8.2)3m,l反应温度为25℃,SOD样液添加量为10μl。 联合提取的SOD的比活力达到5 056U/mg蛋白质。[结论]通过现代生物工程集成技术从猪血中分级提取了4种生物活性物质,所提取的SOD具有较好的活性。 　　超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是广泛存 在于好氧微生物和动植物中的金属酶[1],它能够清除超氧阴 离子自由基,从而有效地防御活性氧对生物体的毒害作 用[2],具有抗氧化、抗炎症、抗衰老、抗癌、抗突变、抗辐射等 功能,其制品已经被广泛用于医药、食品、化妆品、保健品等。 动物血细胞中含有大量的SOD,国内学者利用我国丰富的动 物血资源,对从动物血中提取SOD的工艺进行了大量的研 究,但这些研究都是从动物血中进行单一SOD的提取, 生产成本较高,在实践中难以推广应用。该研究以猪血为原 料,利用现代生物工程集成技术,探讨猪血中SOD等多种活 性物质的联合提取工艺,从而为猪血SOD规模化生产和猪 血资源的合理利用奠定基础。 1　材料与方法 1.1　猪血的采集　猪血采自河南郑州市肉联厂提供的各项 检测指标均合格的健康成年猪,加入38 g/L柠檬酸三钠 抗凝。 1.2　生物活性物质的分离　将抗凝健康猪血3 000 r/min离 心20min,获得的上清液和沉淀分别为血浆和血细胞。在 20%饱和硫酸铵(pH 7.0;山东大明消毒科技,中国滕州)中 对血浆进行盐析。离心后,沉淀的主要成分为纤维连接蛋 白。在50%饱和硫酸铵(pH 7.0)中对离心后的上清进行第 2次盐析,离心后,沉淀的主要成分为免疫球蛋白。将等体积 蒸馏水加入血细胞沉淀中,搅拌30min使其混匀并溶血。离 心后,滤液可采用有机弱酸HA-有机弱碱BOH作溶剂,以无 机强碱调节pH值为5~6,血红素析出[6]。滤渣备用于SOD 的提取。 1.3　SOD的提取 1.3.1　SOD的粗分离。向溶血过滤后的滤渣中加入等体积 的蒸馏水,剧烈搅拌混匀,于4℃静置过夜,使其充分浸润。 再向其中缓慢加入0. 2倍体积的-20℃预冷的95%乙醇 和0. 1倍体积预冷的氯仿搅拌15min。静置1 h后,3 500 r/min 离心25min,收集上清液即SOD粗品液,记录其颜色和澄 清度。 1.3.2　SOD的纯化。采用热变性—等电点—丙酮分级沉淀 合用的方法[7]。首先将SOD粗提液先在55℃下处理15 min[8],然后调节pH值至其等电点3~4,最后加入终体积为 1.0%的丙酮,收集沉淀。向沉淀中加入去离子水,溶液即为SOD提纯液。采用DEAE Sepha-dexA-50层析柱进行纯化,纯化产物即为SOD精品液。分别记录SOD提纯液和精品液的颜色和澄清度。 1.4　SOD活性测定条件优化 1.4.1　邻苯三酚的用量。取7支试管分别加入3 ml 50mmol/L的Tris-HCl (pH 8.2;Tris,于(25±0. 5)℃的恒温水浴 中温浴10min。然后,将5、6、7、8、9、10μl同样温浴的邻苯 三酚溶液分别加入试管中,迅速摇匀, 立即倾入1 cm比色杯中,UV 2000紫外可见分光光度计测定OD325,每隔30 s测定1次,连续记录5min,以自氧化速率控制在0.058~0.072ΔOD325/min标准来确定邻苯三酚的加入量。最后一管不加邻苯三酚溶液,作为参照。1.4. 2　SOD样液添加量。在2支试管中分别加入3 ml50mmol/L的Tris-HCl (pH 8. 2),然后分别加入10、20μlSOD样品液(比活力5 000U/mg蛋白质;于(25±0.5)℃的恒温水浴中温浴10 min。然后,将7μl同样温浴的邻苯三酚溶液分别加入试管中,迅速摇匀, 倒入1 cm比色杯中,测定OD325,每隔30 s测定1次,连续记 录3min。调节样液体积,使样液中邻苯三酚的氧化速率控 制在(0.034±0.002)ΔOD325/min,记录此时样液体积。以不 加SOD样液的空白管作为对照。 1.4. 2　SOD样液添加量。在2支试管中分别加入3 ml 50mmol/L的Tris-HCl (pH 8. 2),然后分别加入10、2