猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002.docVIP

一，酶消化法制备猪胎儿成纤维细胞 猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用 1. 3. 1　剪切　猪妊娠 35 d， 剖腹手术取出子宫， 用 75% 的酒精浸泡消 毒，无 菌 取 出 胎 儿，用 含 双 抗 的 PBS ( 137mmol /L NaCl 2. 7 mmol /L KCl 10 mmol /L NaHPO4 2 mmol /L KH2 PO4 1 mmol /L CaCl2 0. 5mmol /L MgCl2 ) 漂洗 2 遍， 放入含双抗的 PBS 中分离2 个胎儿,放于塑料平皿中, 用无 Ca 2+、Mg2+ PBS 缓冲液洗涤 次, 洗至无色, 备用。将洗涤好的胎儿转移到另一平皿中,用无菌剪子剪掉头,四肢, 尾,去掉内脏, 继续用无Ca2+、 Mg2+- PBS 缓冲液洗涤数次, 洗至无色, 然后用剪子将胚胎×105个/ml)(或者转入到10mm平皿中，在38.5℃，5%CO2和饱和湿度培养）于39℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养。12小时候观察细胞贴壁生长状况，（原代培养 24 h 后， 可见细胞贴壁生长，来源：借助慢病毒将 EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）一般在第二天换液，随后隔天换液，逐天观察，待细胞将80%-90%培养瓶铺满后即形成细胞单层，开始进行传代。一般消化 1 个猪胎儿获得的细胞可接种 2 个 50 ml的培养瓶。 如下图为传代培养第一代的西藏小型猪胎儿成纤维细胞图： （来源：借助慢病毒将 EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞） 1.3.4传代培养及纯化（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究） 清洗：先吸出旧培养液，再用无钙，镁离子的PBS缓冲液冲洗胚胎成纤维细胞3遍，去除血清和脱落的组织块及死细胞的PBS。 消化：加入0.1%胰酶消化液（或者1ml0.25%胰酶+1mmol/lEDTA 4Na)约2ml作用1-3min,(37℃培养箱中消化约5min),倒置显微镜下观察细胞质收缩变圆，（然后立即加入2ml消化终止液（DMEM+10%FBS)终止消化，然后仔细吹打细胞悬液，将细胞悬液收集至15ml离心管中，700r/min离心10min,弃去上清液后，再用培养液DMEM+20%FBS重悬浮细胞，并轻轻吹打使细胞分散均匀，传入新的培养皿中继续培养。 本内容来源：借助慢病毒将 EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）即可倒掉消化液，继续作用约1分钟。 分瓶：轻敲瓶底使成纤维细胞脱落瓶壁，加入STO培养液（STO培养液的配置：FCS (fetal calf serum)10 ml; L-glutamine 1 ml; No-AA 1 ml;β-mercaptoethanol 100μl;DMEM 88 ml。）终止消化。充分吹打使细胞团成为单细胞悬液，以1×105个/ml的密度传入25ml（或50ml)传入新鲜培养瓶中继续培养，一般一瓶细胞可以传2-3瓶。 1.3.4细胞的冻存和复苏（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研 究） 消化：猪胚胎成纤维细胞培养2代后，选择长至80~90%汇合生长的旺盛的细胞，弃 去培养瓶中的原DMEM培养液，用无Ca，Mg PBS缓冲液洗3次，加入胰酶消化液，作用约1~3分钟，弃去胰酶消化液，再稍微作用约1分钟，直到轻敲瓶底细胞层出现断裂，加入培养液终止消化液的作用。 计数：用红细胞计数板计算冻存细胞总数。 收集细胞：用吸管将其吹打成单细胞悬浮液并将其转移到离心管，1000rpm/min离心 10分钟。 分装：弃去上清液，用冻存液（含10%DMSO的培养液）约1 ml收集细胞，分装于冻存管中。一般一个50ml培养瓶的细胞可以冷冻两管。 冷冻过程：将冷冻管中的细胞在4℃冰箱冷冻半个小时后在-20℃冰箱冷冻2~3小时，然后转入-80℃超低温冰箱中过夜保存，第二天转入液氮中长期保存。细胞悬液的冷冻速度对冷冻效果的影响很大，多数细胞以每分钟下降1℃的速度降至﹣20℃，冻结均可获得满意效果。 解冻：从液氮中取出冻存管，立即放入40℃温水中不停搅动，令其快速解冻，时间控制在一分钟内。 接种细胞：将细胞悬液移入离心管中，加入等体积STO培养液，立即放入离心机中，1000 rpm/min离心10分钟，弃去上清液，加入新鲜培养液，充分吹打接种到预先2小时涂有明胶的培养瓶中，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。 对状态良好的细胞要及时冻存、编号。低代细胞由于避免了长期体外传代引起的基因不稳定和细胞表型变化，可保持原细胞的特征。但当细胞离开活体开始体外培养后，它的各种