杂交瘤技术1.pptVIP

 （一）细胞的融合 是指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的现象。它可使两个不同来源的细胞核在同细胞中表达功能，这样的细胞称异核体。若异核体出现有分裂时，则可使两个不同来源的细胞核的染色体汇聚，形成合并有亲本的大核，这样的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid cell）。 自然情况下： 受精过程就是完美的细胞融合过程 在炎症区，常见巨噬细胞融合成的多核巨细胞，也是细胞融合 1961年 Barski在研究中观察到培养的体细胞发生融合现象 1962年 Okada首先用仙台病毒（流感病毒）诱导细胞融合成功，自发的动物细胞发生频率很小，但当加入病毒后，细胞融合的频率显著增大，因病毒的磷脂包膜与动物细胞膜十分相似，某些病毒的糖蛋白还有促进细胞融合的功能，仙台病毒已成为公认的细胞融合剂。 此外还可用聚乙二醇（polywtheglycol ，PEG）作为细胞融合剂，它可使邻近的细胞膜粘合，继而使细胞合并起来。 杂交细胞的产生是随机的细胞间融合的结果，如何从非杂交的细胞中筛选出成功的，有用的杂种细胞，是十分关键的问题。1964年，little-field创立了HAT选择培养基，又将细胞融合技术推向一个新的发展时期。 H为hypoxanthine （次黄嘌呤）A为aminopterin （氨基喋呤）T为thymidine （胸腺嘧啶核苷）HAT选择出理想杂交瘤细胞，选择培养基其机制如下： 糖+氨基酸 氨基喋呤（A）-叶酸拮抗物 核苷酸 DNA 胸腺嘧啶核苷 TMP 核苷酸前体 TK HGPRT 次黄嘌呤 TMP DNA的生物合成途径 一般细胞在培养中合成DNA有二条途径 主要合成途径 即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取的简单的含碳、含氮复合物来合成嘌呤及嘧啶核苷酸。这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基，故该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断； 补救旁路途径 细胞可通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料 氨基喋呤（A)阻止嘌呤嘧啶的合成，凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），即HGPRT缺乏的细胞是不能存活的，但当它与正常细胞杂交后，可从正常细胞中获得补救旁路途径所需酶而合成DNA。 所以需人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine,8-AG)作用于细胞株（如SP2/0），可选育出缺乏HGPRT的细胞株，这是因为HGPRT+的细胞利用了8-AG后，因合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT-的细胞可在8-AG的培养基中生长。若这种细胞单独存在于HAT培养基中不能存活，而将死去。由此可见，HAT选择培养基及补救旁路途径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后选择出杂交细胞株的关键因素。 （二）单克隆抗体（monoclonal antibody technique McAb) B淋巴细胞在抗原刺激下能增殖分化，转变成产生抗体的浆细胞。若将单个产生特异性抗体的B淋巴细胞分离出来，使之在体外分化增殖，产生一大群即一个克隆的细胞，这样便可得到大量的、结构相同的、均一的、针对抗原某一决定簇的抗体，这种由一个克隆B淋巴细胞产生的抗体又称单克隆抗体。 由于B淋巴细胞不能在体外无限增殖，而体内是无法制备单克隆抗体的，抗原接种于机体产生的均为多克隆抗体。因此给单克隆抗体的制备带来困难。体外细胞融合技术为单克隆抗体的制备奠定了基础。 1975年Koehlert和Milstein利用杂交瘤技术，使以绵羊红细胞（SRBC）免疫后小鼠的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0或NS-1）融合，建立了能定向产生SRBC单克隆抗体的杂交细胞株，这一杂交细胞株具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点，因此可以不断地从细胞培养上清液中获得单克隆抗体。单克隆抗体的问世被誉为免疫学中的一次革命，它对生物学、医学各领域产生了巨大的影响 1、单克隆抗体制备全过程 可溶性抗原或 免疫鼠（末次免疫后3-5d） 骨髓瘤细胞SP2/0 颗粒性抗原 解剖取脾制成细胞悬液 取对数生长期制成 细胞悬液 离心1000rpm 10min计数 1000rpm 10min计数 1.5-6x108 1:1或4:1 1.5x108 混合，离心1000rpm 10min 饲养细胞 去上清，加PEG融合（预温） 加无血清1640稀释（预温