实验2亲和层析法纯化胰蛋白酶.docVIP

猪胰蛋白酶的亲和层析制备及测定 内容提要 利用亲和层析（affinity of chromatography）技术纯化胰蛋白酶是一个综合性实验。首先从鸡卵清中分离胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶（sepharose-4B）上，制成鸡卵粘蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析方法从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋白酶。 本实验要求掌握亲和层析的原理和方法；凝胶层析和离子交换层析技术；酶活性测定方法和抑制活性测定的原理和方法。 原理 亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多醣类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲和层析技术就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最佳的方法。 亲和层析是由吸附层析发展起来的，主要是根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的。所谓亲和力是指：范德华力、疏水力、静电力、氢键等，它存在于某些分子内部，也是维系着某些分子之间的结合力。酶与底物、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与激素受体等彼此分子之间的结合力就是亲和力。亲和力是很弱的，只有在彼此分子挨得很近的条件下才显示出来。所以要求两分子之间的结合具有高度特异的分子基础，即分子间的互补结构。利用这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析，就称为亲和层析。它相对于建立在物理化学原理（如分子颗粒大小、分子带电荷状况等）的分离方法而言，可称为“生物专一吸附”的层析分离方法。在亲和层析过程中，被分离的生物分子在一定的条件下，有选择性地，即高度特异地被结合到共价偶联的不溶性载体的配基亲和吸附剂上，改变原有条件，如选用竞争性抑制剂、底物、辅助因子或采用不同pH的缓冲液、高浓度盐、变性剂等，又可有选择性地从亲和吸附上把被分离物质洗脱下来。通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可提高几倍、十几倍甚至几百倍。活性回收率也是非常高的。 亲和层析需要选择耐用的、非特异性吸附少的、水不溶性的载体，并可在温和条件下与配基共价偶联，而又不影响配基原有的生物学特性。最常用的载体是琼脂糖凝胶（Sepharose-4B）。它具有机械强度高，透性好，非特异性吸附少等优点。此外，用作载体的材料还可以有纤维素、葡聚糖凝胶、多孔硅胶、树脂等。但是它们都具有不同程度的非特异性吸附。目前使用得并不多。 1967年Axen, Porath和Ernback报道了采用溴化氰活化琼脂糖凝胶，并把含有氨基的生物分子偶联到多糖基质上的方法。这从而把亲和层析技术向前推进了一步。 溴化氰活化载体是目前用得最多、效果最好的活化方法。但是，由于溴化氰容易分解，在贮藏和使用过程中产生少量有剧毒的氢氰酸及溴。因此，在操作时要戴防毒器具，并要求在通风橱内进行实验。 1967年Porath又报道了应用无毒性的环氧氯丙烷在碱性条件下活化载体的方法，解决了在无通风橱的普通实验室里进行载体活化的难题，使亲和层析技术得到更广泛的应用。除了这两种活化剂外，其他的活化剂还有戊二醛、1，4-丁二醚等。载体的活化及蛋白质配基偶联的反应如下： 2. 溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联 3. 活化载体“接臂” 在亲和层析过程中，如果以一个小分子作为配基（如有机胺类），而被分离物质又是一个大分子，二者在结合过程中就会受到空间阻碍，影响结合。必须在载体和配基之间连接一段有机小分子，称之为“手臂”，使载体上的配基向外延伸以增强配基和被分离物质之间的接触面，减少空间阻碍，提高亲和层析的结合效率。合成这种亲和吸附剂要经过载体活化、连接“手臂”、“手臂”活化及配基偶联等步骤。 本实验采用的是猪胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白作为配基的。鸡卵粘蛋白是一种特异性胰蛋白酶抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用，但对糜蛋白酶无抑制作用。在pH7.6—8.0的范围内，猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵粘蛋白亲和吸附剂上，在pH2.5—3.0的条件下，又能从鸡卵粘蛋白亲和吸附剂上洗脱下来。因此，采用鸡卵粘蛋白为配基合成的亲和吸附剂，可从猪胰脏的粗提液中，通过亲和层析直接获得高纯度的猪胰蛋白酶，比活可以达到（1.5—2.0）×104BAEE单位/mg，相当于5次重结晶的胰蛋白酶的纯度，纯化效率可达到10—20倍以上。 一、主要仪器，材料和试剂 1.仪器 恒温水浴（规格25—100℃），紫外分光光度计，核酸蛋白质紫外检测仪，pH酸度计，组织捣碎机，离心机，循环水真空泵，层析柱（?15×400mm， ?12×200mm），透析袋，尼龙网（200目），抽滤瓶，布氏漏斗（800mm），玻璃烧