哺乳动物基因工程xin.ppt

反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。 反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。 反转录病毒的一般生物学特性 反转录病毒载体的主要类型 辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体 此种带外源选择标记基因的重组病毒基因组有缺陷，不能合成自身蛋白质，故包装所需的全部蛋白质需靠辅助病毒提供。 不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体 当用缺陷性的重组的反转录病毒质粒载体，例如pMLV-gpt DNA传染ψ2包装细胞株时，它便会整合到寄主染色体DNA上进行转录，合成出具有psi序列的反转录病毒载体RNA。 三、工程胚胎干细胞法 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。 胚胎干细胞介导法：是将外源基因直接导人ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引人的外源基因传递下去。 第四节 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 某些氨基酸在代谢过程中能生成含一个碳原子的基团，经过转移参与生物合成过程。体内的一碳单位有：甲基(－CH3，methyl)、甲烯基(－CH2，methylene)，甲炔基(－CH＝,methenyl)、甲酰基(-CHO,formyl)及亚氨甲基(-CH＝NH,formimino)等。 一碳单位的代谢 一碳单位不能游离存在，通常由其载体四氢叶酸（FH4）携带。 哺乳动物细胞内的基因扩增现象 氨基喋呤（MTX）是二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲蝶呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因得以扩增。抗性细胞通过增加相关基因的拷贝数，提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。而且与基因相邻的DNA区域同时也被扩增。 DHFR-MTX系统 GS-MSX高效表达系统： 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX系统优越之处。 通过强化基因转录高效表达外源基因 在载体上安装病毒或细胞来源的强启动子以及有效的翻译元件，也可使外源基因高效表达。 细胞巨化病毒CMV的启动子 动物珠蛋白基因的内含子 SV40的终止子和polyA化信号序列 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利于翻译，有的还有信号肽序列。 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体 大多数恶性淋巴癌细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath。用人源化的小鼠抗campath抗体治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效果良好。重组抗体采用DHFR-MTX系统表达。 利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂 第一个由重组哺乳动物细胞规模化生产的医用蛋白是治疗急性心肌梗塞的溶血栓药物：人组织纤溶酶原激活剂（tPA）。同样采用DHFR-MTX系统表达。人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。 第五节 转基因动物的应用研究 改良动物经济性状的尝试试图通过转移单个基因改良动物经济性状的研究，至今仍未见成功的报道，尚需对性状表现的生化代谢途径，有关基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表达、组织特异性表达等进行深入的研究。 乳腺生物反应器的研究1987年，Gordon首次报道小鼠乳腺中表达tPA蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成功报道实例已有10多种，生产出抗胰蛋白酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白因子Ⅷ、蛋白质C等药用蛋白。国外经济学家预期，10年后，转基因动物生产的药物销售额超过250亿美元。 基因药物生产 第一阶段是细菌基因工程 第二阶段是动物细胞基因工程 第三阶段是转基因动物—乳腺生物反应器。 制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜消毒灭菌， 用它包装的DNA在4℃下可长期保存不失活性， 脂质体载体法的优越性： DNA显微注射法 应用玻璃显微注射器，可以把重组DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核。 真正的显微注射(true microinjection)法