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实验4 荧光显微镜的使用 荧光显微镜(fluorescence microscope)是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光，再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具，通常用于检测与荧光染料共价结合的特殊蛋白质或其他分子。由于它灵敏度高，用极低浓度(PPM级)荧光染料就可清楚地显示细胞内特定成分，故可进行活体观察。因此，可以用来观察活细胞内物质的吸收与运输，化学物质的分布与定位等；近年来发展起来免疫荧光显微技术，可将荧光素标记抗体，利用抗体与细胞表面或内部大分子(抗原)的特异性结合，在荧光显微镜下对细胞内的特异成分进行精确定位研究；与分光光度计结合构成的显微分光光度计，可对细胞内物质进行定量分析，精确度高，可测得10-15g的DNA含量。目前许多新兴生物研究领域如基因原位杂交（FISH）都等应用到荧光显微镜。由于荧光显微镜技术具有染色简便、标本色彩鲜艳，敏感度高、特异性强的特点，在细胞生物学研究领域已被广泛应用。 荧光显微镜的原理：某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质，如叶绿素、血红素、维生素、脂褐素、核黄素等经紫外线照射后可产生自发荧光；还有些细胞成分虽然受照射后不发荧光，但可以用荧光物质或荧光染料（如酸性品红、甲基绿、吖啶橙等）处理标本使其有选择性地带上荧光染料，经紫外线照射后可诱发荧光，称为继发荧光。荧光染料对光的吸收由高度的选择性，其荧光发射也有一定的范围。如吖啶橙的吸收峰在405nm，发射波长为530～630nm，最高峰在565nm，如要获得比较强的荧光，需要选用与匹配的滤片系统。荧光染料的种类很多，不同的染料有不同的使用范围。最常用的荧光染料有以下几种： 表 荧光染料的应用范围 荧光染料 激发光源 应用范围 显色 吖啶橙 蓝光 细胞核 细胞核橙色、细胞质无色 荧光增白剂 蓝紫光 植物细胞壁 壁黄绿色 二丙酸酯荧光素 蓝紫光 细胞脂酶 活细胞质呈黄绿色 H33253 蓝紫光 DNA 蓝绿色 荧光微镜的装置：荧光显微镜与普通光学显微镜结构基本相同，主要区别在于光源和滤光片不同，由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。 光源：现在多采用200W的超高压汞灯作光源。超高压汞灯是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。由于荧光显微镜普遍采用超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。滤色系统：滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530，就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名，如美国Corning厂的NO：5-58，即相当于BG12。 （1）激发滤板 ：根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。 紫外光激发滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波；紫外蓝光激发滤板可使300～450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38；紫蓝光激发滤板可使350～490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。 最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。近年开始采用金属膜干涉滤板，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板，均远比玻璃滤板效果好。激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。 （2）压制滤板：位于标本与目镜之间，可把