碱抽提法提取质粒（Extraction of plasmid by alkali extraction method）.docVIP

碱抽提法提取质粒（Extraction of plasmid by alkali extraction method） 溶液i, 50 mm葡萄糖 / 25 mm Tris CL / 10 mm EDTA, pH 8.0; 溶液ii, 0.2 n NaOH / 1% SDS; 溶液iii, 3 m 醋酸钾 / 2 m 醋酸. Tris - cl溶液: 缓冲液. 50 mm葡萄糖: 使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部. EDTA: 大家知道edta是ca2 + 和mg2 + 等二价金属离子的螯合剂, 配在分子生物学试剂中的主要作用是: 抑制dnase的活性, 和抑制微生物生长.在溶液i中加入高达10 mm的edta, 无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉. 用新鲜的0.4 n的naoh和2% 的sds等体积混合后使用的.要新从浓naoh稀释制备0.4n的naoh, 无非是为了保证naoh没有吸收空气中的co2而减弱了碱性.很多人不知道其实破细胞的主要是碱, 而不是sds, 所以才叫碱法抽提.事实上naoh是最佳的溶解细胞的试剂, 不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞, 碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解, 这是由于细胞膜发生了从bilayer (双层膜) 结构向micelle (微囊) 结构的相变化所导致.用了不新鲜的0.4 n NaOH, 即便是有sds也无法有效溶解大肠杆菌 (不妨可以自己试一下), 自然就难高效率抽提得到质粒.如果只用sds当然也能抽提得到少量质粒, 因为 SDS 也是碱性的, 只是弱了点而已.很多人对naoh的作用误以为是为了让基因组dna变性, 以便沉淀, 这是由于没有正确理解一些书上的有关dna变性复性的描述所导致.有人不禁要问, 既然是naoh溶解的细胞, 那为什么要加sds呢? 那是为下一步操作做的铺垫.这一步要记住两点: 第一, 时间不能过长, 千万不要这时候去接电话, 因为在这样的碱性条件下基因组dna片断会慢慢断裂; 第二, 必须温柔混合 (象对待女孩子一样), 不然基因组dna也会断裂.基因组dna的断裂会带来麻烦, 后面我再详细说明. 每个人都知道, 溶液iii加入后就会有大量的沉淀, 但大部分人却不明白这沉淀的本质. 最容易产生的误解是, 当sds碰到酸性后发生的沉淀.如果你这样怀疑, 往1% 的sds溶液中加如 2m的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了.大量沉淀的出现, 显然与sds的加入有关系.如果在溶液ii中不加sds会怎样呢, 也会有少量的沉淀, 但量上要少得多, 显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质.既然 sds不是遇酸发生的沉淀, 那会不会是遇盐发生的沉淀呢? 在1% 的sds溶液中慢慢加入5 n的nacl, 你会发现sds在高盐浓度下是会产生沉淀的.因此高浓度的盐导致了sds的沉淀.但如果你加入的不是nacl而是kcl, 你会发现沉淀的量要多的多.这其实是十二烷基硫酸钠 (sodium dodecylsulfat (E) 遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 (potassium dodecylsulfate, PDS), 而pds是水不溶的, 因此发生了沉淀.如此看来, 溶液iii加入后的沉淀实际上是钾离子置换了sds中的纳离子形成了不溶性的pds, 而高浓度的盐, 使得沉淀更完全.大家知道sds专门喜欢和蛋白质结合, 平均两个氨基酸上结合一个sds分子, 钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了, 让人高兴的是大肠杆菌的基因组dna也一起被共沉淀了.这个过程不难想象, 因为基因组dna太长了, 长长的dna 自然容易被pds给共沉淀了, 尽管sds并不与dna分子结合. Then why is the acetic acid of 2 M added? To neutralize NaOH, because long alkaline conditions interrupt DNA, so neutralize it. Once the genome DNA breaks, as long as it is 50-100 KB size fragments, there is no way to be precipitated by PDS. Therefore, the alkali treatment time is short, and must not be intense oscillation, otherwise, the final plasmid will always have a large number of genomic DNA mixed, agarose electrophoresis can be observe