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三氧化二砷对乳腺癌细胞株抑制作用及其机制探析作者单位：056105 河北省冀中能源邯郸矿业集团总医院（赵振江）；邯郸市中心医院（李海新） 通讯作者：赵振江 【摘要】 目的 探讨三氧化二砷（arsenous oxide ,As2O3）对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用及其机制。方法 对乳腺癌MCF-7细胞株进行培养传代。As2O3作用于细胞一定时间后利用流式细胞仪检测乳腺癌细胞凋亡率；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测survivin基因的表达；电镜观察乳腺癌细胞凋亡情况。结果 As2O3对乳腺癌细胞的抑制作用是以促进细胞凋亡为主；凋亡抑制因子survivin基因在乳腺癌细胞中表达；乳腺癌细胞经As2O3作用后，能抑制survivin基因的表达。结论 As2O3可能通过抑制凋亡抑制因子survivin基因的表达，促进细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤的作用。 【关键词】 三氧化二砷； 细胞凋亡； 癌基因 本实验以MCF-7乳腺癌细胞为靶细胞，观察As2O3对MCF-7细胞的生长抑制作用。 1 材料与方法 1.1 细胞培养及给药方法 乳腺癌MCF-7细胞经培养进入对数生长期时，以一定浓度接种于培养板中，贴壁后给药，三氧化二砷组选用0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml三种浓度，在给药48 h后，分别对诱导MCF-7细胞凋亡状况进行检测。生理盐水作为阴性对照组，1.0 μg/ml DDP作为阳性对照组。 1.2 流式细胞仪检测乳腺癌细胞凋亡率 收集各As2O3组细胞1×107个，1000×g离心5 min，细胞沉淀用PBS洗1次，分散成单细胞悬液，加入70%冷乙醇4 ℃固定过夜。1000×g离心5 min，弃去上清液，用少量PBS重悬细胞，加入碘化丙啶PI，终浓度为50 μg/ml，混匀，4 ℃放置1 h，在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。 1.3 透射电子显微镜观察透射电镜下肿瘤细胞超微结构观察 收集培养细胞，用PBS洗2次，2.5%戊二醛4 ℃固定，1%饿酸后固定30 min，梯度酒精脱水，树脂包埋，超薄切片，铅铀染色透射电镜观察，拍照。 1.4 RT-PCR检测survivin基因的表达 在MCF-7细胞培养瓶内加入As2O3（1.5 ml/well），细胞100%病变后消化收集各组细胞，采用TRIZOL法提取总RNA，用DNA/RNA测定仪测定RNA的浓度和纯度。常规方法进行逆转录。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min, 94 ℃ 30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30个循环。Survivin引物序列上游：5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CT-3’；下游:5’-GAC AGA AAG GAA AGC GCA ACC-3’，扩增产物为229 bp；β-actin上游:5’-TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA -3’;下游:5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG -3’，扩增产物为302 bp。PCR产物经8%聚丙烯酰氨凝胶电泳,溴化乙锭（EB）显色,Bio-profif凝胶图像分析系统进行摄像分析。通过survivin/β-actin的灰度比值作相对定量。 1.5 统计学处理 数据分析应用SPSS 12.0软件处理，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，使用t检验。 2 结果 2.1 流式细胞术分析 实验组的肿瘤细胞均可见有G1前期细胞形成的凋亡峰，阴性对照组对照组（1A）、0.5 μg/ml组（1B）、1.0 μg/ml组（1C）、2.0 μg/ml组（1D）凋亡率分别为5.4%、21.9%、26.4%、36.9%。见图1。 2.2 透射电镜下肿瘤细胞超微结构改变 三氧化二砷（2 μg/ml）时透射电镜下见细胞质浓缩，核碎裂，染色质浓缩于核膜（图2）。 2.3 As2O3诱导乳腺癌细胞凋亡时survivin基因表达的变化 从图3可知，survivin基因在乳腺癌细胞中存在高表达。RT-PCR结果显示，As2O3诱导乳腺癌细胞凋亡时，survivin基因的mRNA受到抑制。对照组Survivin gene/β-actin为（0.502±0.174），阳性对照组为（0.407±0.134），1.0 μg/ml As2O3组为（0.392±0.105），DDP组和1.0 μg/ml As2O3组分别与细胞对照组比较，差异均有统计学意义（P 1