中药乙醇提取物对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA水平的作用.pdfVIP

大连医科大学 硕士学位论文 中药乙醇提取物对豚鼠皮肤酷氨酸酶mRNA水平的影响 姓名：马景昕 申请学位级别：硕士 专业：皮肤病与性病学 指导教师：涂彩霞 中药乙醇提取物对豚鼠皮肤酪氨酸酶删刚A水平的影响 硕士研究生：马景昕 指导教师：涂彩霞 教授 专业名称：皮肤病与性病学 摘 要 白癜风是一种色素脱失性皮肤病，促进黑色素生成的药物可能具有治疗作用。 酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶。本文选择在离体实验中对酪氨酸酶有激活作用 的旱莲草等7种中药，以棕色豚鼠为动物模型，采用nl】RNA原位杂交和逆转录． 聚合酶链反应的方法，观察中药外涂对豚鼠皮肤酪氨酸酶ln]RNA水平的影响，同 时用Sc}吼orl法染色和Dopa-氧化酶染色观察中药促进色素生成及黑素细胞增殖的 作用，从分子水平和细胞水平探讨中药致色素的作用机制。 材料与方法：中药：旱莲草、夏枯草、女贞子、鸡血藤、刺蒺藜、薄荷、甘 草，阳性对照为补骨脂。中药分别用90％乙醇提取其有效成分，选用棕色豚鼠为 agcaaaacat 实验动物模型。豚鼠酪氨酸酶nlRNA原位杂交探针序列：1一acctg∞m g粕tggatcaactcccat垂，3‘tctggatgcanactat簪gtc∞gagata。碧i} accatcagtg，2一gcca龃tgaa 氨酸酶RT．PCR特异性引物序列：鼠酪氨酸酶：5’一TTCAAAGGGG AATGCATCC．一3’(319bp)。 TGGATGACCG一3’，5’—GACACATAGT 中药外涂豚鼠皮肤4周后，制成豚鼠皮肤冰冻切片分别进行以下实验：l、 mRNA原位杂交探针，并用地高辛进行标记，在冰冻组织切片上进行豚鼠酪氨酸 酶r11RNA原位杂交，高倍镜视野下计数每100个基底细胞中m心n原位杂交结果 呈阳性的细胞数，并用HP队S一1000高清晰度彩色病理图文分析系统对原位杂交切 片进行灰度分析。2、逆转录一酶聚合酶链反应(RT·PCR)：冰冻组织连续切片，提 取总RNA后进行酪氨酸酶RT．PCR，PcR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，凝胶扫 描仪上观察结果并拍照。3、动物致色素实验：采用D叩a-氧化酶和schmorl等方 法染色，分别计数每lOO个基底细胞中Dopa染色和黑素颗粒染色为阳性的细胞数， 观察外用中药对黑素细胞增殖和黑索生成的作用。 结果：1、原位杂交结果显示中药组的组织切片上原位杂交呈阳性的细胞数均 明显高于乙醇组和生理盐水组(PO．01)，尤其以旱莲草、夏枯草、刺蒺藜等显著。 中药组原位杂交信号的灰度值明显低于乙醇组和生理盐水组(PO．01)，其中以旱 莲草、夏枯草、刺蒺藜和薄荷的作用显著，与阳性细胞计数的结果相一致。乙醇 组_j}Ⅱ生理盐水组阳性细胞计数和灰度值结果之间没有显著的差异(Po．05)。 2、RT—PCR结果显示中药组与乙醇组和生理盐水组比，7种中药能显著上调 豚鼠酪氨酸酶rrIRNA水平。 3、中药致色素实验：Dopa一氧化酶染色示7种中药能使豚鼠表皮基底层内多 鼠表皮基底层中含有黑素颗粒的细胞数增多(PO．01或(0．05)。 中药上调mRNA水平与促黑素生成和黑素细胞增殖作用不完全平行，刺蒺藜 等的致色素作用与上调mRNA水平不完全平行。 结论：本实验显示早莲草等7种中药对豚鼠皮肤均具有上调酪氨酸酶的基因表 达的作用，还可促进黑素生成和黑素细胞增殖。刺蒺藜等对酪氨酸酶的基因表达 和致色素作用不完全平行，提示中药的作用不仅限于酪氨酸酶的激活，即不仅在 转录水平上起作用，还可能影响黑素细胞的增殖和黑素颗粒的生成。 关键词： 中药酪氨酸