补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞组织蛋白酶K表达的影响.doc

　　补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞组织蛋白酶K表达的影响 林一峰，梁祖建，何铭涛 【摘要】 【目的】 探讨组织蛋白酶K(cathepsin K，CK)在骨质疏松症发病中的意义，观察补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞CK表达的影响。【方法】选用30只雌性SD大鼠随机分成3组：假手术组、模型组及补肾通络方组(中药组，剂量为1246 g·kg-1·d-1);后2组切除双侧卵巢，4周后中药组给予补肾通络方灌胃。分别于第6、12周测定各组大鼠全身骨密度(BMD)，并采用EM培养基及胎牛血清(FBS，美国Gibcol 公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(BioRad公司)，超敏发光液(北京利莱公司)，Trizol总RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)，SF300塑料薄膜封口机(温州兴业公司)，CO2培养箱(德国Heraeus公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，SD)测定分别于第6、12周，各组大鼠按33mL/kg腹腔注射100mg/L水合氯醛溶液腹腔麻醉后，四肢展开平置于双能X线吸收测量仪平台上，通过计算机系统中小动物软件测定全身BMD。 　　16破骨细胞的培养[4]将大鼠断颈处死后，在无菌条件下分离腰椎(L1~5)，体积分数75%的酒精浸泡1min，在4℃DHanks平衡盐溶液中清除骨表面的软组织、骨膜后，用4℃αMEM冲洗液冲洗2次，在培养皿中剪碎骨组织，加10mLαMEM冲洗液一起转移入Ⅰ号离心管，在漩涡振荡器上振荡5s，静置7s，将上层细胞悬液经细胞筛网过滤到Ⅱ号离心管中，去掉骨碎片，然后再加入10mLαMEM培养液入Ⅰ号离心管振荡，将上层细胞悬液经细胞筛网过滤到Ⅱ号离心管中，重复上述步骤3～4次，收集细胞悬液。将所收集的细胞悬液在离心机上离心10min，4℃、2000r/min，弃上清，沉淀中加入破骨细胞诱导液，用吸管轻轻吹打混匀。以血细胞计数器计数，使悬液含细胞数为15×106个/mL，分别加入预置小牛骨片(厚约60μm)的24孔板、预置盖玻片的6孔培养板内，置37℃，含体积分数5%C02的空气，饱和湿度的孵箱中培养，24h后换破骨细胞诱导液1次。 　　17破骨细胞的鉴定[5] (1)形态学观察：倒置相差显微镜观察培养破骨细胞的形态，苏木素—伊红(HE)染色，光镜观察;甲苯胺兰染色，光镜观察。(2)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：将破骨细胞爬片用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，再置入体积分数25%戊二醛固定液中，4℃、固定15min，PBS冲洗3次，放入TRAP染色液中，37℃温育1h。取出破骨细胞爬片，双蒸水冲洗3次，晾干，中性树胶封片，光镜观察。 　　18)室温下轻摇1min，排去液体，以保鲜膜包裹，用X线光片在增感屏中紧密接触，使X线光片感光1min，显影，定影，冲洗，晾干，拍照。采用Band Scan 50凝胶图像分析软件分析光密度值，以CK/βactin光密度比值来表示CK蛋白表达水平。 　　19逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)法测定CK基因的表达收集培养稳定后的破骨细胞，总RNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行，以此RNA为模板，进行逆转录反应合成cDNA，取上述cDNA5μL进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。CK基因上游引物：5CAGCTTCCCCAAGATGTGAT3，下游引物：5TGGAGGACTCCAGCGTCTAT3;GAPDH上游引物：5TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT3，下游引物：5CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC3，反应条件：94℃ 变性5min;94℃、30s，57℃、30s，72℃、30s，共32个循环; 72℃延伸 5min，凝胶扫描成像系统记录电泳结果。 采用Band Scan 50凝胶图像分析软件分析光密度值，以CK/GAPDH光密度比值来表示CK mRNA表达水平。 　　110统计学方法应用SPSS 130医用统计软件包进行数据统计学分析。 　　2结果 　　21各组不同时间点BMD值比较表1结果显示：不同时间点模型组BMD较假手术组显著降低，差异均有显著性意义(P001)，说明造模成功。中药组BMD较模型组显著增加(均P005)，且中药组骨密度术后12周较术后6周显著增加，差异有显著性意义(P005)，说明中药补肾通络方能提高骨密度。 　　22破骨细胞的鉴定图1(彩图见第439页)结果显示：倒置相差显微镜下观察，骨髓细胞悬液培养30～40min即可见破骨细胞贴壁，细胞逐渐伸展，开始时夹杂有较多血细胞、单核细胞、成熟破骨细胞、骨髓间质细胞等，随着培养时间延长及换液，造血细胞和大部分基质细胞被冲洗掉，而遗留下贴壁较牢的破骨细