利用膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时系统观察心肌细胞浆内钙离子的释放 synchronous observation of ca2+ release in cardiac myocytes by patch clamp and confocal microscope.pdfVIP

第”卷第2期 电子显微学报 V01．27．N0．2 2008年4月 ofChineseElectron 2008．04 Journal MicroscopySociety 文章编号：1000．6281(2008)02—0127—04 利用膜片钳一激光扫描共聚焦显微镜同步实时 系统观察心肌细胞浆内钙离子的释放 沈亚峰1，梁 文2，雷长海1，汤 莹1，范小燕1，羊富光1，杨勇骥H，祝；建2。 (1．第二军医大学基础部生物物理研究所，上海200433； 2．同济大学生命科学与技术学院电镜室，上海200433) 摘 要：目的：采用膜片钳和激光扫描共聚焦显微镜同步实时系统观察心肌细胞钙离子的释放。方法：在体外培 养的单个心室肌细胞上进行全细胞模式膜片钳技术和共聚焦显微镜钙成像技术相结合，同步实时记录钙火花和钙 离子浓度变化。结果：在全细胞模式膜片钳记录心肌细胞膜钙电流的同时。激光扫描共聚焦显微镜可准确记录到 胞浆内出现的钙火花。此技术有可能对于明确钙火花的特征。准确理解兴奋一收缩偶联的微观机制有重要意义。 关键词：膜片钳；激光扫描共聚焦显微镜；钙火花；心肌细胞；钙电流 文献标识码：A 中图分类号：Q6；Q2；Q336 细胞膜将细胞与外界隔离，细胞膜上存在各种 内发生的钙火花现象。 ””…。“。“ 票篓墨竺竺之竺主攀至翼≮竺+譬要票苎等竺1材料与方法 内部与外环境的联系通道，是研究神经、肌肉和其它 生物组织、细胞兴奋性和生物电的基础…。1976年1．1材料 德国科学家Neher和Sakmann【23建立了膜片钳技术，实验动物用雄性SD大鼠，250g一350g，购自第 用于检测离子通过细胞膜上的离子通道时产生的十 二军医大学动物中心。荧光试剂Fluo．3．AM(美国“巧 分微弱的电流，通过这种方法可以记录通过离子通 公司进口分装)。 道的离子电流来反映细胞膜上单一(或多数的)离子 1．2方法 通道活动的技术。激光扫描共聚焦显微镜可利用 1．2．1细胞分离 Fluo．3、Indo一1、Fura．Red等多种荧光探针，对单个细利用酶解方法分离得到单个心室肌细胞。简要 胞内钙离子的比例及动态变化作毫秒级实时定量分 过程如下：①雄性sD大鼠(250 g。350g)经乌拉坦 析，完成活细胞生理信号的动态监测。钙火花(Ca2+(1g／kg)腹腔注射麻醉；②开胸腔出心；③经主动脉 I型胶原酶逆向灌 分别用无钙台氏液和0．6mg／ml sparks)现象最早发现于心肌细胞，是一种新发现的 重要生理现象bJ。钙火花现象主要表现为当心肌肌 流心脏；④切碎心肌并经适当吹打过滤即可获得分 纤维(或细胞)、骨骼肌肌纤维(或细胞)去极化时局散的单个心肌细胞。⑤分离下的心肌细胞在KB液 部区域ca2+的大幅度增加。随着对离子通道的进中保存。 一步研究，作者将膜片钳系统和激光扫描共聚焦显 1．2．2荧光染色 tool／ 微镜系统联机以实现同步实时记录离子电流、离子 心肌单细胞与钙荧光指示剂Fluo一3AM(511 浓度和分布的变化，从而达到细胞离子释放的功能 L)共同孵育30min，室温，避光，之后用KB液漂洗3 和形态学研究的统一。本文利用膜片钳刺激心肌细 次，