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进行性肌营养不良产前基因诊断探究DMD致病基因位于Xp21，由于临床症状、实验室检查、肌电图及骨骼肌租化染色病理表现相似，需要借助免疫组织化学染色、Western印记、聚合链酶反应或基因测序，在蛋白或基因水平上进一步分型诊断。近10年来运用分子生物学技术完成了该病的基因定位、cDNA 克隆、外显子全序列测定等关键工作。现就DMD型疾病产前主要基因检测手段及策略进行介绍。 1 DMD是最常见的遗传疾病 在河北工程大学附属医院儿科遗传咨询门诊就诊的申请产前诊断的患者中，DMD最常见占60%，准确提供这种遗传病的诊断，可解决目前临床实践中大部分相关疾病的诊断问题。 DMD系X-连锁隐性遗传病，是由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因（也称DMD基因）突变所致的肌源性损伤。贝氏进行性肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）也由DMD基因突变所致，发病较DMD晚，而且12最后之后还能行走。白种人中DMD发病率为1/3500活产男婴，约2.5%的女性携带者因不行的“菜昂化”而得病，但症状比男性轻。所谓“菜昂化”是指X染色体灭活现象，人类女性两条X染色体中随机有一条在胚胎期发生失活。如果女性杂合子正常基因所在的X染色体灭活导致细胞功能异常，则为“不幸的莱昂化”。一旦“不幸的莱昂化”细胞占优势，个体就会患病。由于其组织中还有一些细胞是正常的(缺陷基因所在x染色体失活)，因此相对于男性患者而言症状要轻。 DMD基因编码的抗肌萎缩蛋白与其他肌浆蛋白形成复合体，与膜蛋白一起形成细胞骨架，并与细胞外蛋白结构连接。复合体中其他蛋白组分缺陷也可导致复合体功能异常，引起类似DMD的肌肉疾病如肢带型肌营养不良(1imb-girdle dys-trophy，LGD)，且多为常染色体隐性遗传，易与不典型DMD(尤其是BMD)混淆，应注意鉴别诊断。 2 基因结构特点 DMD基因位于Xp21，基因组DNA片段长约2.3 Mb，由79个外显子组成，cDNA长约14 kb。在DMD基因内存在许多重复序列，形成许多断裂和交换热点，导致基因缺失／重复及容易发生新生突变。 3 基因突变的特点 DMD基因突变的主要类型是基因片段缺失，在基因5端和3端分别存在一个缺失高发区，尤其后者，以外显子51区域为高峰，中国人病例近80％的缺失突变发生在此区域[5]。其中大范围(一个或数个外显子)缺失型占60％，重复型突变占6％，还有缺失区域不连续或同一患者既有缺失又有重复的复杂突变。通过序列分析显示，微小缺失占3％，单核苷酸改变占29％ 4 基因突变检测 联合应用各种基因突变检测技术可对绝大部分病例进行致病突变鉴定。对于不能鉴定出突变 的个体，应考虑其临床诊断是否准确。 4.1 基因缺失/重复突变检测 Southern印迹法是检测基因缺失的经典方法，而PCR(polymerase chain reaction)技术的应用使缺失突变检测变得更简便。最初采用多重外显子PCR扩增检测DMD缺失突变，后来又创建了各种定量检测基因片段的方法，如定量一PCR(quantitative-PCR，Q-PCR)、多重可扩增探针杂交(multiplex amplifi-able probe hybridization，MAPH)、多重连接依赖式探针扩增(Multiplex ligation-dependentprobes assay，MLPA)技术等，可对DMD基因79个外显子进行分析，不仅可检测基因缺失还可检测基因重复。联合应用各种DNA分析手段，对于DMD致病突变基因综合检测能力可达98％，可直接确诊DMD患者，并且将来有可能取代创伤性肌肉活检的病理诊断；而对BMD病例的检测能力仅60％，尚需进一步研究，部分BMD病例可能属于抗肌萎缩蛋白复合体中其他蛋白的异常。 4.2 点突变的检测策略 对于非缺失／重复型DMD突变，可应用DHPLC或高分辨溶解曲线分析(high resolution melting curve assay，HRM)逐个检测基因外显子，筛查出突变所在的扩增片段后通过PCR产物直接测序确定突变细节。但仅靠基因组DNA分析不能检测到深埋在基因内含子中或基因调控序列中的致病突变，而用外周血提取mRNA后经逆转录(reverse transcription，RT)一PCR进行突变分析则可大大减少工作量。如出现扩增片段数目和长度改变，可直接判断基因缺失／重复及影响剪切的突变，而对未发生改变的其他患者，可逐个对RT—PCR片段进行突变筛查和测序 5 遗传咨询中应提供的信息 5.1 新生突变与生殖腺嵌合 DMD病例中，新生突变多见，这是DMD的另外一个特点，表现为散发性、无家族史。严格的新生突变