12分离差异表达基因的方法.docVIP

学校代码： 10589 学号： Y0620908 分 类 号： 密级： 海南大学 硕 士 学 位 论 文 题 目：应用cDNA-AFLP进行番木瓜性别标记研究 作 者： 李 亚 丽 指导教师： 熊建平 教授 周鹏 研究员 专 业： 农业生物技术 时 间： 二○○九年六月 摘 要 番木瓜(Carica papaya L.)属于番木瓜属番木瓜科的多年生常绿大型草本植物，植株分雌性株、雄性株和两性株三种基本性别类型。番木瓜主要采用杂交种子，苗中通常有5%雄株、20-30%雌株和60-70%两性株。两性株与雌株相比在结果性能、果实品质及形态等方面具有较优势，因在实际生产中以两性株。番木瓜性别在幼苗和营养发育期从形态上区分，只有到6至8个月后开花结果时才能鉴别在生产上通常采用三株近植到时将不需要的拔掉，这对生产造成极大的浪费。由于番木瓜遗传机制和性别表现复杂性，苗期缺乏有效的鉴定方法因此深入研究番木瓜苗期不同性别之间的基因差异表达，番木瓜苗期性别调控的机理苗期性别鉴定的研究，对番木瓜育种和栽培生产均具有重要理论意义。 本研究利用多重PCR技术鉴定出番木瓜苗期的植株性别，依此为基础选取材料构建混合样品池。cDNA-AFLP操作中选用EcoRI和MseI两种限制性内切酶酶切双链cDNA，经检测酶切涵盖率较高。在预扩增后分别优化选择性扩增的各影响因子，建立了选择性扩增体系。通过选择性扩增产物检测筛选了40对有差异的引物组合。经过聚丙烯先凝胶电泳检测，最后建立了番木瓜性别研究的cDNA-AFLP分析体系。 经检测筛选47条差异表达的cDNA片段（雄性14；两性9；雌性12；雄性和两性12），并对其进行Blast同源性检索及序列分析，13条片段没有同源性片段，这些在番木瓜中表达且具有特殊的功能，可作为新的基因；34条片段在中找到同源序列，22条为具有功能的基因及生理代谢番木瓜幼苗期雄性发育相关的差异表达cDNA片段(编号为M13)与脂加氧酶的核酸序列具有88%的相似性，脂加氧酶及下游产物茉莉酸是拟南芥雄性致育所必需的因子。在此基础上挑选了10个差异片段设计特异引物进行了RT-PCR检测，6个差异片段与幼苗期性别的调控相关，提供了重要的实验依据。：番木瓜性别鉴定cDNA-AFLP分析体系基因差异表达Abstract Papaya (Carica papaya L.), a tropical fruit tree, belongs to genera Carica, family Caricaceae which is perennial evergreen herb. It is a polygamous diploid (2n=18) with three sex types: male, female and hermaphrodite. At present, papaya is manly breed by hybrid seed. Among the seedlings, 5% are usually male, 20-30% are female and 60-70% are hermaphrodite. Compared to female, hermaphrodite has an advantage in ability to produce fruits , fruits quality and fruits shape. Therefore, hermaphrodite is more desirable than female in agricultural production. However, at the seedling stage and juvenile phase, it is very difficult to distinguish the gender of papaya from morphology which can only be done after it flowered and bore fuits at 6-8 months . Papaya is commonly cultivated by three seedlings nearby followed