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PCR突变技术方法概览 1基于PCR 的体外诱变技术 定点突变的方法很多，而基于 PCR 的定点突变技术由于其突变效率高，操作简单，耗时短，成本低廉等优点而倍受瞩目。近十年来，基于 PCR 的定点突变技术获得了长足的发展，目前运用此技术已能实现各种类型的基因突变。 基因突变实验包括以下几个步骤:1目的基因全序列变异文库的构建;2利用高通量表达筛选载体从变异文库中筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。 1.1 重叠延伸PCR（over-lap extension PCR OE-PCR） 这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除及插入。 其基本原理如图（1）所示。首先设计两个 PCR 反应以产生两个含突变位点的 DNA 片段，随后将上述两个 PCR 产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次 PCR 产物进行纯化处理可显著提高突变效率。 OE-PCR 不足之处在于：○1一个突变需要两对引物，3次 PCR，并且需对中间产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济； ○2由于 DNA 二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合导致目的产物得率很低；○3当利用 Taq 聚合酶进行PCR 反应时，经常在 PCR 产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生非预期的移码突变。 针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR 进行了改进。1997年，Urben等提出一步重叠延伸 PCR 法（one-step overlap extension PCR），使得三个 PCR 反应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的 DNA 以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同（例如pUC18,19）。这样便得到两个模板。将这两个模板，两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进行一次 PCR 反应即可得到含突变的目的基因。1997年，Warrens等利用不对称 PCR 反应产生单链中间产物，消除了互补链的竞争性影响，显著提高了目的产物的得率。1990年,Horton等用T4DNA聚合酶处理中间产物，降低了移码突变的发生率。由于OE-PCR几乎没有任何特殊条件的限制，而且成功率很高，因此运用非常广泛。 1.2 大引物 PCR 法(megaprimer PCR) OE-PCR虽然突变成功率很高，但一次突变需要两对引物，进行三个 PCR 反应，还需对中间产物进行纯化。因此，相对而言成本偏高，操作较烦琐。大引物 PCR 法是 OE-PCR 的改进版，利用大引物 PCR 法只需三个引物，两个 PCR 反应，而且无需中间产物纯化等步骤。其方法是先设置一个 PCR 反应产生一个含突变的 DNA 片段，然后再以此 DNA片段作为引物与原模板退火进行 PCR 扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的 DNA 片段较通常的引物要大许多通常有上百碱基，所以命名为大引物 PCR 法。最初采用的大引物 PCR 法突变效率较低，只有约 50%终产物符合预期的要求，因此后续的筛选鉴定工作量较大。后来许多学者通过对引物进行巧妙设计或对模板进行巧妙处理，从而使得大引物 PCR 法达到类似 OE-PCR 的突变效率。例如，有学者等对模板进行适当的酶切处理遏制了野生型模板的扩增，提高了突变效率。Te等在设计引物时使第一轮 PCR 的引物和第二轮 PCR的引物长度相差较大，相应它们的解链温度Tm值也产生显著差异.这样第一轮 PCR 采用低的退火温度,之后在无需纯化的情况下直接加入高 Tm值引物,同时相应提高退火温度,与大引物一起引发第二轮 PCR 扩增。基于这一设计,不仅排除低 Tm值的引物的干扰,使野生型模板不致被扩增,而且省略了大引物的纯化步骤,使整个反应能在一个反应管内进行。 1.3特殊位置碱基的定点突变 如上所述，进行一次突变一般需要经历 1 到 3次 PCR 及中间产物的纯化等步骤。但当需突变的碱基位于某些特殊位置时，就可以简单地运用一次PCR 实现定点突变，下面讨论这样两种特殊情况。 （1）需突变碱基位于基因的末端 当需突变碱基位于基因的末端时，定点突变便非常简单易行。只需设计一对引物，其中一个为突变引物，含有欲突变的碱基，另一个引物则完全与模板互补。此二引物在 5’端均含有适宜的限制性酶切位点及“夹子”序列，以便将扩增产物克隆入载体中，如图 2 所示。 （2）唯一限制性位点删除法(unique site elimination