1实验室与基本操作(植物组织培养).doc

第一章 实验室与基本操作 第一节 实验室及其基本设备 实验室的大小取决于工作的目的和规模： 1. 以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。 2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 实验室设计 标准的组织培养实验室包括：洗涤室（准备室）；配置室；灭菌室；接种室；培养室；观察室等 一、准备室 作用：材料、培养器械的清洗、培养基准备、灭菌等的准备工作。 普通化学实验室：仪器及设备、化学药品。 纯水仪、冰箱、移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、磁力搅拌器、低速台式离心机、电脑等 。 作用：配制培养基。 洗涤室：清洗、贮存器皿设施、鼓风干燥箱等。 作用：玻璃器皿、用具和培养材料的洗涤。 灭菌室： ①高压蒸气灭菌装置：如立式、卧式和手提式灭菌器。 作用：培养基、器械、棉塞、无菌纸等灭菌消毒 ②细菌过滤器 二、无菌操作室 作用：进行植物材料分离接种的重要场所，需长时间的无菌操作，对组织培养成功起关键作用。 试验设施；超净工作台；紫外灯；固定式和移动式载物台；消毒器、广口瓶、酒精灯、酒精棉、机械支架；手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等 超净工作台 (a laminar flow hood) 工作原理:利用鼓风机驱动空气通过高效过滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 三、培养室 作用：进行材料的培养的场所。其大小、规模可根据工作性质设定。以充分利用空间和节能为原则。 设备：可调控光、温、湿度等设备。还有固定式培养架、转床、摇床。适用于器官（芽、茎、花药等）、愈伤组织、细胞和原生质体的固体培养和液体培养。 四、细胞学实验室 作用：细胞学和组织学观察。 设备：需备有高倍显微镜、体视显微镜、倒置显微镜、各种相机、恒温箱、切片机、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。 五、温室 作用：培育组织与细胞培养出来的材料，组培苗的移栽锻炼。 第二节 基本操作 一、洗涤方法 1、重铬酸钾洗液： 饱和的重铬酸钾洗液：43克重铬酸钾溶于1000毫升蒸馏水中（饱和溶液）。按1：1体积比将浓硫酸缓慢地倒入饱和重铬酸钾水溶液中。 流程： （12h） 水洗 → 晾干 → 重铬酸钾洗液 → → 自来水冲净 、蒸馏水洗两次 → 干燥 2、洗涤剂：洗衣粉、洗液 3、超声波洗净器：小型玻璃器皿，顽固性污渍。超声波除污。（要加水） 新的玻璃器皿：0.1﹪HCl浸泡12小时，洗衣粉、自来水洗、蒸馏水冲。 污染的玻璃器皿：要先高压灭菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。 二、灭菌方法 1、干热灭菌：利用鼓风干燥箱（烘箱）进行烘烤灭菌的方法。箱内温度控制在150℃，120min。玻璃器皿. 2、湿热灭菌：利用高压蒸汽灭菌的方法。一般温度为121℃，压力0.1MPa，消毒15～20min。培养基灭菌. 3、熏蒸灭菌：利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。用甲醛内加入高锰酸钾、百菌清、硫磺熏蒸。用3%来苏尔溶液或1%漂白粉水溶液，或0.2%过氧乙酸溶液喷洒、拖擦地板。培养室、接种室灭菌. 4、过滤灭菌：使溶液通过夹有微孔滤膜的漏斗，滤膜孔径需选用0.3～0.45μm。在无菌环境下，用真空泵抽滤，其滤液为无菌。液体培养（不耐高温活性物质） 5、药剂灭菌：用70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸钠、新洁尔灭、Clorox等药剂灭菌的方法。培养材料灭菌。 6、烧灼灭菌：用酒精灯烧灼达到灭菌的目的。接种器具灭菌。 7、射线灭菌：用紫外线照射的方法灭菌。照射时间一般为15～30min。接种时应关闭紫外灯。室内灭菌。 三、无菌操作 1. 接种室以及工作台灭菌：紫外灯30分钟，用时一定要关闭它。 2. 工作台消毒：70%乙醇，用小型喷壶消毒或棉球擦拭。 3. 点燃酒精灯，开启灭菌器,对使用器械进行烧烤灭菌。器械冷却后方可使用。 第三节 培养基的配置 一、培养基成分（culture medium：维持离体细胞生存和生长的溶液） 主要有： 1、无机盐：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。 2、有机化合物：碳源（糖类），维生素类，有机含氮化合物。 3、植物生长调节物质：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸等。 4、附加物类：琼脂，活性炭，椰乳，硝酸银等。 1、无机盐——大量元素和微量元素 大量元素： N：用量最多。常用的有硝态氮和铵态氮，KNO3、NH4NO3植物组织，从培养基中吸收氮后形成蛋白质。 P：在植物组织培养在的细胞增殖分化大量