反相高效液相色谱法同时测定二色补血草茎中芦丁和槲皮素的含量.docxVIP

反相高效液相色谱法同时测定二色补血草茎中芦丁和槲皮素的含量1前言二色补血草(Limoniumbicolor)是蓝雪科(plumbaginaceae)补血草属的多年生草本植物,别名苍蝇花、蝇子草。分布于河北、河南、山西、甘肃、陕西。生于海拔500—2000m的海滨碱滩、草地沙丘。全草入药,性味甘微涩苦,无毒。主要功能:补血、止血、调经、散瘀、益脾健胃。主治崩血、尿血、月经不调、肾癌、胃癌、肾盂肾炎等症[1]。黄酮类化合物有明显的抗溃疡、抗炎及降血脂等系列的生物活性[2],因此在医药和食品上倍受关注。本文采用反相高效液相色谱法同时测定了二色补血草茎中芦丁和槲皮素的含量,方法稳定、快速、重现性好。2实验部分2.1试剂与仪器2.1.1试剂芦丁(国药集团化学试剂有限公司)、槲皮素(上海化学试剂公司)。甲醇为色谱纯,磷酸为优级纯,实验用水为超纯水。二色补血草茎8月采自甘肃省陇西县,洗净,阴干粉碎备用。2.1.2仪器日本岛津公司SPD210Avp高效液相色谱仪(包括SLC210Avp系统控制器、SPD2M10Avp检测器、LC210ADvp高压泵、CLASS2VP控制软件);日本岛津公司AUW120D十万分之一电子天平,韩国Nexpower1000超纯水器(北京通用仪器有限公司),RE3000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。2.2样品溶液的制备称取5.0000g二色补血草茎粉末,置于索氏提取器中,石油醚回流3h,除色素,回收石油醚。然后用80%的乙醇回流5h,过滤,滤渣再用乙醇回流2h,过滤,合并滤液,回收乙醇得浸膏,浸膏以甲醇溶解,过0.45Lm滤膜,备用。2.3对照品溶液的配制准确称取0.3000g芦丁和0.1000g槲皮素,用甲醇超声溶解并定容于50mL容量瓶,再取该溶液10mL,混合并用甲醇稀释至100mL,摇匀,过0.45Lm滤膜,作为备用溶液。2.4色谱条件色谱柱:HypersilODS2柱(4.6mm×250mm,5Lm);检测波长:355nm;流速:1mL?min;柱温为室温;进样量:10LL,分析时间:60min,流动相梯度洗脱条件见表1,HPLC谱图见图1、图2。2.5线性关系试验分别吸取芦丁对照品溶液0.2、0.6、1.0、1.5、2.0mL置于10mL容量瓶中,并用甲醇定容,摇匀,作为标准品溶液。分别取上述标准品溶液10LL进样,平行做3次,测定峰面积,以对照品进样量(Lg)为横坐标,峰面积为纵坐标,利用origin软件进行线性回归。槲皮素校准曲线绘制方法同芦丁校准曲线绘制方法。得到回归方程:y芦丁=-10215.36+1542290x,r=0.9999y槲皮素=-24579.57+2698450x,r=0.9997结果表明:在0.12—1.20Lg范围内,芦丁标准品进样量与峰面积值呈良好线性关系;在0.04—0.40Lg范围内,槲皮素标准品进样量与峰面积值呈良好线性关系。3结果与讨论3.1波长的选择对芦丁和槲皮素对照品溶液分别在190—370nm的范围内进行扫描,芦丁在204nm、255nm、355nm处出现3个吸收峰;槲皮素在202nm、255nm、370nm处出现3个吸收峰。考虑到在短波长处样品中其他组分的干扰较大,在355nm处芦丁有最大吸收,槲皮素在355nm虽未达到最大吸收,但吸收较强,故选取355nm作为同时测定芦丁和槲皮素的测定波长。3.2流动相的选择试验中采用甲醇和0.5%磷酸溶液作为流动相(见表1),在实验中发现,芦丁出峰后适当增大甲醇的比例,不仅可以使槲皮素的保留时间提前,而且可以改善其峰形。3.3精密度试验分别准确吸取2.3中的备用芦丁和槲皮素对照品溶液10LL,连续进样5次,测定峰面积,芦丁和槲皮素的峰面积RSD分别为0.42%和0.95%,表明进样精密度良好。3.4稳定性试验新配制浓度均约为1mg?mL的芦丁和槲皮素对照品溶液,混合后每隔3h进样一次,结果表明芦丁和槲皮素在15h内稳定。芦丁和槲皮素的峰面积RSD分别为0.84%和1.02%。3.5重现性试验样品溶液按2.2方法配制,每次进样10LL,测定芦丁和槲皮素的峰面积RSD(n=5)分别为0.84%和1.95%,表明该方法重现性良好。3.6回收率试验准确吸取5mL样品溶液两份,一份直接定容到10mL,另一份加入定量芦丁和槲皮素后定容到10mL,按含量测定方法测定含量。重复5次,计算回收率,结果见表2和表3。3.7样品测定准确吸取10LL样品液,按含量测定方法测定,记录芦丁、槲皮素面积,代入回归方程计算出样品中芦丁和槲皮素分别为49.6910mg?100g,5.2139mg?100g。4结论二色补血草以其高的观赏价值和奇妙的药用价值而备受人们青睐。近几年通过栽培驯化的途径,成功的对二色补血草进行栽培,资源丰富,开发利用二色补血草前景