人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险.docVIP

人抗凝血酶III转基因羊的外源基因移风险分析青岛森淼生物技术研究所 山东青岛 266061关键词：转基因羊；实时荧光定量PCR；人抗凝血酶III；基因转移 前言随着生物技术的高度发展，转基因动物研究的不断深入和加快，转基因育种成为培养新品种的重要途径，商业化转基因动物即将面世，同时，与转基因相伴而生的潜在的安全问题已引起世界各国的关注和重视[1-2]。转基因动物是通过基因工程技术使生物遗传信息发生了转移、替换、融合和表达的遗传工程体，由于外源基因的插入，打破了原有的育种规律，改变了物种多样性局面，可能发生潜在的生物环境安全问题，造成重大经济损失，对人类生存造成威胁。因此，对转基因动物环境安全的检测和评价有利于保证人类健康和生态环境安全、促进转基因动物相关技术的快速健康发展。 基因转移是指转基因生物中转入的外来基因，转移到相邻的其他生物之中，从而改变其他生物的基因组成[3]。转基因植物发生基因转移可能引起的生态环境安全性问题已经引起广泛关注，而转基因动物发生基因转移的可能性一直没有被重视。因而研究转基因动物发生基因转移的可能性对于评价转基因动物环境安全性具有重要的意义。 本研究建立了实时荧光定量PCR技术检测抗凝血酶III的方法，并充分发挥青岛森淼实业有限公司的转基因羊资源优势[4]，开展抗凝血酶III（ATIII）转基因羊环境安全性评估的初步研究。 1 材料与方法 1.1 材料 野生型山羊、转乙肝表面抗原基因羊、转?-干扰素转基因羊、转ATIII基因羊、狗、鸡和鹅的血样采集于青岛森淼实业有限公司的转基因动物养殖基地；血液基因组提取试剂盒，购自美国QIAGEN公司；TaqMan Universal PCR Master Mix，购自美国Applied Biosystems公司；Taqman探针及引物由大连Takara公司合成；其它普通生化试剂均为国产分析纯。 仪器 美国Applied Biosystems公司7500荧光定量PCR仪和9700型PCR仪。 引物及Taqman探针设计 利用Primer Primer 5.0软件分析人ATIII基因的序列（NM_000488），设计并合成用于构建标准质粒的人ATIII特异性引物（F：5’-gtgataggaactgtaacct-3’；R：5’-cggccagcaatcacaacag-3’）。利用Applied Biosystems公司的Primer Express 3.0软件设计Taqman探针和引物（F：5’-TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG -3’；R：5’-GCTTGGCTGTGCAGATGTC -3’； Taqman探针：5’-(FAM) TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG (Eclipse)-3’）。利用BLAST在线软件分析设计引物和探针序列的特异性。引物及探针委托大连Takara公司合成。 血液基因组DNA的制备 血样采用EDTA抗凝，血液置于1.5 ml离心管中4 ℃保存备用。利用QIAGEN离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组。 1.5 ATIII基因的扩增 以转ATIII基因羊（A22）血液基因组为模板。PCR扩增体系如下：25 μl的体系，DNA模板3 μl，l0×Ex Taq bufer 2.5 μl ，dNTP(2.5 mM)2.5 μl ，引物F (10 pM)，引物R (10 pM)，Taq酶0.2 μl，ddH2O补到25 μl。反应条件为94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 S，55 ℃ 30 S，72 ℃ l.5 min，25个循环；72 ℃ 10 min。扩增片段大小为1263 bp，以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果并回收。 1.6 ATIII基因的克隆 利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将ATIII基因PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书)，胶回收产物连接到pMD18T载体中，转化E.coli DH5α，挑取单克隆，PCR鉴定，并测序鉴定。 1.7 质粒标准品浓度的计算 将上述质粒用紫外分光光度计测定260 nm与280 nm波长下的OD 值，判断其纯度(OD：260 nm/OD280 nm1．8者为纯品)，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数：每微升质粒拷贝数= (质量/分子量)×(6.02×1023)=[质粒浓度(ng/lμl)×lμ]×10-9/2404697]×(6.02×1023个/mo1)，其中：6.02×1023是阿佛加德罗常数；2404697是标准质粒的分子量。标准品作10倍梯度稀释，-20 ℃保存备用。 1.8 荧光定量PCR检测 25 μl反应体系包括TaqMan Universal PCR Master Mix缓冲液12.5 μl，血样DNA模板10 ng，引物和探针浓度按具体实验添加