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乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作程序 1.目的：明确乙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测。 2.适用范围： 2.1适用于进行乙肝病毒核酸定量检测的检验人员。 2.2适合仪器：LightCycler型核酸扩增荧光检测仪 2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术 2.4样品要求：血清 3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4.试剂来源：中山大学达安基因股份有限公司HBV DNA荧光PCR检测试剂盒。 5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6.标准操作： 6.1 试剂准备（在试剂准备区操作） 6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（Taq酶为液态试剂，临用前取出，用后立即放回冰格），完全融解后混匀。 6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1管阴性对照+1管阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品)（定性检测无需做阳性参控品）， 取PCR反应管，转移至样本制备区。 6.2 样本制备及加样（在标本制备区操作） 6.2.1 取血清标本40ul，或阴阳性对照标准品各10ul（强阳性标准品使用前加入稀释液90ul混匀），加等量DNA提取液打匀，（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后填满吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截）。沸水浴10分钟，转至4℃静置8-12小时以保证病毒颗粒充分裂解。 6.2.2 10000rpm离心5分钟，取上清液2ul直接加入到PCR反应管中，6000rpm离心数秒。 6.2.3 将各反应管带入PCR仪。 6.3 PCR扩增（在扩增区操作） 按仪器使用说明或标准操作程序操作。 扩增条件如下：93℃→2分钟预变性 93℃ 30秒 → 55℃ 60秒（40个循环） 6.4 结果判断： 6.4.1 2个阴性对照的Ct值应无数值，1个强阳性对照的Ct值应小于等于30，1个临界阳性对照的Ct值应大于阳性对照的Ct值，并小于等于38，否则实验视为无效。 6.4.2 4个阳性参控品的基因拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标，作标准曲线，标准曲线的拟合度R应大于等于0.990，否则应视为实验无效。 定量结果分析：上述两项质控标准均满足时，可对样品进行定量分析。分析数据时，根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度。若发现有标本Ct值小于15，须将其剔除此次结果分析，该标本稀释后再测直至其Ct值大于15。 6.5 报告 6.5.1 定量结果判断 检测样本中HBV-DNA≥1×103拷贝数/ml（copies/ml）时，按实际检测结果报告； 检测样本中HBV-DNA1×103拷贝数/ml（copies/ml）时，均报告“低于检测下限”。 6.5.2报告的签发依据检测结果报告程序。 7.支持性文件： 7.1 《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒》说明书（中山大学达安基因股份有限公司） 7.2 检测结果报告程序。 7.3 LightCycler型核酸扩增荧光检测仪 本记录归档周期1年保存期限5年 管理编号： 生化检测流程记录表 实验日期＿＿年＿＿月＿＿日 本表使用说明： ①各项目执行后在相应的方框内打√。②实验室内的温度为１８-２８℃，湿度５０－７０％为合格范围。③实验室清洁、消毒按SOP文件执行。④本表保存在归档文件夹中，存放文件柜中保存2年。⑤日立7600生化分析仪中检验结果保存计算机中，保存2年。 前期准备□记录室内温度＿＿＿湿度＿＿＿□冰箱温度：冷藏＿＿＿冷冻＿＿＿ □仪器在校准有效期内（校准之日起1年），开机，仪器工作状况：正常□。 □检查清洗液□ 清洁样品针、试剂针、搅拌棒、清洗头□ 异常：记录（包括故障及纠正方法） 保养记录： □检查仪器试剂量，记录添加试剂量 试剂名称 模块 添加量 试剂生产厂家批号 　　 □ 实验纯水，记录阻值：＿＿＿＿ 操作者：＿＿＿＿ 检测记录 １、 ２、 ３、 室内质控物来源＿＿＿＿， 4、审核质控结果：在控□；失控□；失控记录（包括纠正措施） 实验结果审核：发现不符合项记录＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，无□。 审核者：＿＿＿＿＿ 实验后消毒记录 ５、 □打开紫外线灯，紫外线灯照射记录 灯1照射时间 灯1照射累计时间 灯2照射时间 灯2照射累计时间