烟草细菌枯萎.pptVIP

烟草青枯病;研究背景; 该病在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、湖北、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。 ;一、症状;枯萎; 研究内容; TTC平板培养48h后青枯菌菌株的菌落形态 TTC培养基：NA培养基中加入三苯基四氮唑（TTC）.;烟草青枯菌分离菌株来源;2 病原菌的纯化和保存 从TTC培养基上挑取呈不规则圆形，中心淡粉红色，周围白边较宽，流动性强的单菌落进行纯化，2-3次后，用接种环挑取少量细菌于灭菌水中20℃保存。 3 青枯菌的分子鉴定 通过常规PCR，利用青枯菌种的特异性引物759／760，对分离获得的菌株进行分子鉴定，根据扩增结果来确定是否为青枯菌。 ;引物序列：759 ：GTCGCCGTCAACTCACTTTCC 760：GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG PCR扩增采用25μL反应体系，其中10×PCR buffer 2.5μL，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs200μM，引物759和760各1μL，DNA 5μL。 反应程序为：95℃2 min； 94℃20s， 30 68℃30s， 72℃30s； 72℃延伸10min。; 3.青枯菌的分子鉴定结果 ;三、烟草青枯菌菌系分化研究 1.青枯菌生理小种鉴定 供试菌株：从湖北恩施地区烟草青枯病病株上分离的54个青 枯菌菌株。 鉴别寄主：烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生和辣椒 接种方法：1mL细菌悬浮液（浓度为108cfu／mL ），注射到5- 7叶期的寄主茎基部。 培养条件：温度30℃，相对湿度80%以上。 小种划分：接种7天后，调查接种植株的抗感反应，根据Budenhagen、华静月等人制定的生理小种划分标准，确定菌株的生理小种归属。 ;青枯菌的生理小种划分标准;烟草青枯菌接种生理小种鉴别寄主; 鉴定结果表明：54个烟草青枯菌菌株接种6种鉴别寄主均能使其致病，发病率均为100%，侵染的植物种类范围符合生理小种1号的侵染范围，因此可将供试菌株划分为生理小种1号。; 2.烟草青枯菌生化型测定 根据菌株对3种双糖（乳糖、麦芽糖、纤维二糖）和3种己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）的利用程度，将菌株划分为不同的生化型。;测试项目; 生化型测定结果表明：54个烟草青枯菌菌株均能利用3种双糖和3种己醇，根据青枯菌生化型划分标准鉴定均为生化型Ⅲ。 ;3.烟草青枯菌演化型鉴定 参照Fegan和Prior的方法，用7条引物扩增青枯菌株DNA，根据扩增的片段大小确定供试菌株的演化型。 ; DNA提取：用TaKaRa试剂盒提取菌株的DNA。 PCR扩增采用25μL反应体系，其中包括： 10×PCR buffer 2.5μL， Taq酶2U， MgCl21.5mM， dNTPs 200μM， 引物759和760各4pmol，引物Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23:AF， Nmult22:InF，Nmult22:RR各6pmol， DNA模板50ng。; 反应程序为： 96℃5 min； 94℃15s， 30 59℃30s， 72℃30s； 72℃延伸10min。 取5μLPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5V／cm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。; 反应程序为： 96℃5 min； 94℃15s， 30 59℃30s， 72℃30s； 72℃延伸10min。 取5μLPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5V／cm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。;四、青枯菌的寄主范围;五、烟草青枯病田间发生动态研究 调查地点：湖北恩施州宣恩县和咸丰县烟田 调查时间：2013年6-8月 调查方法：采用双行平行跳跃法定点定株调查 调查内容：发病时期，发