NEPA21悬浮转染标准操作步骤pdf.PDF

NEPA21 电转染操作步骤（悬浮转染/ 电转杯转染适用） 仪器和试剂 1. NEPA21 主机 2. 电转杯腔（CU500 ） 3. 电转杯架（CU600 ） 4. 电转杯（EC‐002S，2mm 间隔，内含专用吸管）  若使用 EC‐002，需配合使用加长的电泳加样Tips 。 5. EP buffer ：Opti-MEM 培养基 (Invitrogen Sku# 31985-062, 31985-070 or 31985-088) 注意事项：必须保证Opti-MEM 培养基无抗生素，无血清。 6. 质粒 DNA （pCMV-EGFP ，储存浓度 1μg/μl 每管，溶于TE 缓冲液中，由NEPA 公司提供） 7. 细胞培养板或培养皿（供电转后细胞培养用，请根据不同细胞选用合适规格的培养板/皿，一 般建议准备6 孔板或30mm dish ） 实验步骤 一、 细胞悬液的制备 6 1. 根据细胞量 1×10 /管准备细胞。 2. 用胰蛋白酶消化、收集细胞；用含血清的培养基终止消化 （该步骤适用于贴壁细胞，若悬浮 细胞则直接进入步骤3 ）。 3. 离心并弃去上清，加入 EP buffer 进行重悬细胞团块。吹打几次，以洗去培养基中的血清。 4. 重复第 3 步2-3 次，最后将细胞重悬于EP buffer 中。 注意事项：1.必须保证细胞悬液无抗生素、血清残留，否则会大大降低细胞的转染效率。 2.上下吹打细胞使其成为细胞悬液，无结团。 5. 取少量悬液进行细胞计数并确定浓度，根据浓度和细胞悬液的总体积，算出总细胞数量。 二、 细胞+DNA 混合液的制备 将一定量的细胞与质粒DNA 混合，充分混匀，使其最终浓度达到每管100 μl 混合液中含有1×106 细胞+10 μg DNA 。其中细胞体积为90 μl，质粒DNA 体积为10 μl。 例如：进行12个程序，需要准备13 管细胞+DNA 混合液（为避免分装损失，需多备一管） 7  所需细胞总量：1.3×10 ：从已知浓度的细胞悬液中取足量的细胞，离心后用1170 μl EP buffer 重悬。  所需 DNA 总量：130 μg。取130 μl 质粒DNA （储备液浓度为1μg/μl ）。  1170 μl 细胞液+130 μl 质粒DNA=1300 μl 细胞/DNA 混合液。充分混匀，不可产生气泡。 注意事项： 1. 如细胞总量不足，每管的细胞量可相应减少，但同时转染效率会降低。例如：每管使用5×105 细胞，DNA 用量不变，细胞/DNA 混合液总体积仍为100 μl； 2. 如每管的细胞量降低至 5×105 细胞仍不够做12 个程序时，应适当删减程序。 三、 电转实验 1. 预先准备两个6 孔细胞培养板，或12 个30 mm 的培养皿，每孔加入2 ml 预 热的完全培养基（含血清）。 2. 将细胞/DNA 混合液分装至12 个电转杯中，100 μl/杯，并做好标记。 注意事项：必须准确加入100 μl 的细胞/DNA 混合液，以保证获得相似的 电阻值，提高实验的重复性 3. 设置电转染参数。 4. 用手轻轻敲打电转染杯，使气泡上升至液面表面并清除。 5. 将电转杯放入电转杯腔。 6. 按下“Ω”键，测定并记录电阻值。 注意事项：测量得到的电阻值应处于30-50 Ω之间。 7. 按下“start”健，执行电转程序。记录程序执行后，仪器显示的电流、能量等参数，可用于Trouble shooting。 8. 取出电转杯，用配备的吸管，从预先准备好的6 孔板或30 mm 培养 皿中吸取少量培养基（约200-300ul ），加入电转杯中轻微吹打2-3 下， 然后将悬液全部吸出，加入到6 孔板或30mm培养皿中。必要时，重复 冲洗电极杯一次，以便将全部的细胞转移到培养板/皿中继续培养。 注意事项：刚受过电击的细胞非常脆弱，必须马上将电转杯中的细胞悬液转移到培养皿中培养！ 不可以待全部电转杯都完成电击后，再进行细胞的转染，否则存活率会大大降低！ 9.