单个细胞分离技术PBMC.pptVIP

一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）（一）葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞 密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自然停转 1.分离液：葡聚糖-泛影葡胺混合液（比重1.075～1.092之间） 将分离液，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。 ◆红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层， ◆单核细胞比重较小（1.075～1.090），分布于血浆与分离液的交界处。界限清楚，层次分明。将该层细胞吸出，即为单个核细胞（主要为淋巴细胞） ◆血浆和血小板位于最上层。血小板在血浆中下部 2. Hanks缓冲液：（ pH 7.2-7.4,无Ca、Mg离子） 3. 0.4%台盼蓝染液 梯度离心法——分离提取单个核细胞 肝素抗凝血2ml +Hank’s液2ml液稀释 沿管壁缓慢加入到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中(不能破坏二者的液面）,2000r/min 离心20min 吸出淋巴细胞层加入另一试管中，加3～4ml Hank’s液，混匀离心洗涤， 1500r/min 离心10min 弃去上清，再加3ml Hank’s液，混匀， 1500r/min 10min，重复洗涤2次 重复1次  末次离心后，弃去上清液。加含10%灭活小牛血清/HanK‘s液 加至1.0ml，混匀，灌入血细胞计数池，单个核细胞计数， 于低倍镜下计数4个角大格内细胞总数。 计数细胞方法 加样： 将淋巴细胞悬液混匀，吸取10μl加入到 40μl含10%灭活小牛 血清的Hank’s液中，混匀后再吸取10μl充入计数板上。 细胞悬液稀释5倍。此稀释也可省略，可根据细胞密度而定 静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。 具体计数方法如下： 单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量） 单个核细胞总数/ml= 细胞存活率检测 取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl， 混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻， 置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞 分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。 【结果判定】 活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器： 【临床意义】 分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一，是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作； 是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。 分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要， 不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定， 也用于进一步纯化淋巴细胞，进行淋巴细胞分类，分群， 表面抗原，各种标志物以及其他淋巴细胞功能测定等。 * 美丽的海医校园 临床免疫学实验指导 海南医学院 实验六 单个核细胞分离及细胞免疫功能检测 【实验目的】 1.熟悉淋巴细胞分离方法 2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义 T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的 单个核细胞（L, M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞 （CTL或TC）发生特异性细胞毒效应. 临床上反复感染者和肿瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有 细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫缺陷的检测，而这种检查的 第一步就是单个核细胞的分离，计数。然后进行功能检查。 稀释血浆 内含血小板 分离液 粒细胞 红细胞 用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内 加入PBS洗液3-4ml，离心洗涤2次，1500/r,10min. 弃去上清，留约50μl.加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml，混匀充池，镜下计数。 单个核细胞 2000rpm/ 20-30min 方法 留取约50μl,加缓冲液至1.0ml，稀释20倍 ▲ 血细胞计数池的构造 大方格 9个 中方格分2种 WBC计数区分16个 RBC计数区分25个 3.小方格1种， 是指RBC计数区 的1个中方格又分 16个小方格，即： 计数池内有：1种 大方格；2种中方 格；1种小方格 池深 0.1mm 血细胞计数池的构造参数 4种方格的体积（容积） 计数池区域 边长（mm） 面积（mm2） 池深（mm） 体积（mm3 ul） 一个计数全池 3 9 0.10