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FFPE样品制备和分析宝典 FFPE样品制备和分析宝典 摘要： 本文介绍了制备和保存FFPE样品的方法，可尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。接下来介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。FFPE样品制备和分析的宝典，绝对不容错过！ 全世界福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片的存档代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。随着越来越多的研究人员转向FFPE样品的分子分析，开发特定的操作步骤，考虑这些样品的独特性质就变得越来越重要。本文为完整的FFPE流程提出了建议。其中介绍了制备和保存FFPE样品的方法，其目的在于尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。接下来介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。 一、制备和存档FFPE样品时的重要考虑因素 从FFPE样品中提取出的核酸和蛋白的质量取决于固定和包埋之前、期间和之后如何处理样品。在这一部分，我们确定了影响生物分子质量的主要因素，并建议采取哪些措施，以尽量减少这些因素的影响。 1 样品类型 每种组织都有其特定的生理功能，并就其结构和组成细胞而言是独特的。取决于组织类型，收获后生物分子降解、诱导或修饰的速度可能各异。因此，组织切除和固定的操作应尽快开展（详见2 样品处理）。从富含纤维或脂肪的FFPE组织中纯化分析物时，不需要特殊的裂解条件：相反，福尔马林交联和石蜡的存在决定了分析物提取的要求（详见后文）。 在处理肿瘤组织时，应当注意健康和恶性细胞并不是均匀分布的。因此，同一个组织样品中一块切片的分析结果可能与另一块切片不同。 2 样品处理 从病人身上获得组织标本的手术涉及麻醉、血管结扎、组织的切除以及固定。从病人麻醉到组织固定这段时间内，组织中的基因表达可能发生变化，且可能发生组织自溶。因此，组织固定前的操作时间应当越短越好，以避免RNA转录本和蛋白表达谱发生明显改变。操作中每一步的时间应记录在案，这是最低要求。 3 福尔马林固定 组织的固定是将标本放在福尔马林溶液中，此溶液的组分可能有所差异（典型的10%福尔马林溶液可能含有3.7% 甲醛以及1-1.5% 甲醇）。产生的化学反应导致生物分子之间的交联，包括核酸之间、蛋白之间，以及核酸和蛋白之间的交联。为了获得最佳的结果，应当使用中性的福尔马林缓冲溶液，以取代无缓冲或酸性的溶液。中性缓冲液减缓福尔马林的降解，而通常认为其降解产物会损害核酸的质量。 而另外3个影响组织固定程度的因素也很重要：组织标本的厚度、福尔马林溶液的体积和固定过程的持续时间。固定不足（underfixation）可导致组织标本中福尔马林未渗入的较深区域的核酸和蛋白降解，或基因表达发生改变。过度固定（overfixation）则导致更密集的交联，让有用核酸和蛋白的提取变得更加困难。 福尔马林大约以1 mm/小时的速率渗透组织。此外，福尔马林的渗透速率随组织厚度的增加而降低。因此，在固定一个组织标本时，它应当足够薄，以避免周边的过度固定和中间的固定不足。在一个比较不同大小样品固定过程的实验中，QIAGEN的研究人员发现，在固定整个组织（厚度大约1 cm），而不是组织切片（厚度约4 mm或以下）时，RNA显著降解（图1）。为了获得最佳的结果，通常建议固定最多5 mm厚的组织标本。 福尔马林与组织的比例至少应为10:1，以确保最佳的固定。在处理小的组织标本，如穿刺活检时，这很容易实现。然而，在处理大的组织样品时，固定所用的福尔马林可能不足。在这种情况下，组织切片应当切割后再进行福尔马林固定。 组织的固定不应超过24小时，以避免过度固定。在一个比较过夜固定和72小时固定的实验中，QIAGEN的科学家观察到，固定时间对RNA完整性几乎无影响（图2）。然而，他们也发现，72小时固定对纯化后RNA在一步法RT-PCR中的表现有不利影响：较大的扩增子无法成功扩增，这极有可能是因为RNA分子的过度交联和较高比例的不可逆交联（图1）。另一个实验表明，72小时的固定降低了FFPE样品中蛋白的回收率（图3）。这种不利影响同样是由于交联增加。 图1. 样品厚度对RNA完整性的影响。大鼠组织以整个器官或≤4 mm的切片进行福尔马林固定和石蜡包埋。A 包埋后3天利用RNeasy? FFPE Kit 纯化RNA，并利用Agilent? 2100 Bioanalyzer分析。在整个大脑的电泳峰图中，双箭头指出了18S rRNA和28S rRNA的峰减少，表明RNA片段化的增加。B 纯化的RNA被用于一步法