张家冲流域土样采样方法及biolog步骤.docxVIP

张家冲流域土样采样方法 1.采样方法 1.1取样器具 小铁铲x 2、自封袋 x 50、50ml离心管 x 170、干冰箱 x 1、保温箱 x1 (4 冰块)、手套标签纸以及记号笔等若干。 1.2 取样方法 张家冲流域水土流失试验田设置了坡度、植物篱、不同植物等的对照组，用以测试这些限制因素对水土流失的影响。为了研究不同对照组下土壤内微生物与其对应植物的相互关系，我们对试验田内的土壤进行了取样。由于坡度对土壤微生物影响不大，我们舍弃了坡度处理，采样样方共十个（表1）。每个样方取样按三个生物学重复操作，在其上、中、下各取三个点，每个点用五点取样法取样，但为了减少空气中的微生物对土样的影响，我们采取的是以下采样方法。 用已消毒（高压灭菌锅或75%究竟擦洗）的铁铲剥开表层土样，用五点采样法，每次约取50ml土（5次约250ml）迅速置于已编号的自封袋中，然后立即将自封袋放入装有冰块的保温箱中。待回到室内先将各土样混匀，然后分装到已编号的离心管内。如此，各土样有5个重复，其中3份将用于高通量测序，1份用于biolog及土壤理化性质测定，1份作为备份。将用于高通量测序的三份置于-20度的冰箱中保存，用干冰箱寄回学校，继续放入-20度冰箱中保存；另外两份土样放入4度冰箱中保存，随保温箱带回学校，放入4度冰箱。  表1.土样编号与试验田处理对照 编号处理取样点1a石砍梯田+农作物（花生）上1b石砍梯田+农作物（花生）中1c石砍梯田+农作物（花生）下2a土坎梯田+柑橘上2b土坎梯田+柑橘中2c土坎梯田+柑橘下3a坡+植物篱+柑橘上3b坡+植物篱+柑橘中3c坡+植物篱+柑橘下4a土坎+植物篱+柑橘上4b土坎+植物篱+柑橘中4c土坎+植物篱+柑橘下5a坡+植物篱+茶叶上5b坡+植物篱+茶叶中5c坡+植物篱+茶叶下6a坡+农作物(花生)上6b坡+农作物(花生)中6c坡+农作物(花生)下7a坡+植物篱+农作物（花生）上7b坡+植物篱+农作物（花生）中7c坡+植物篱+农作物（花生）下8a坡+柑橘上8b坡+柑橘中8c坡+柑橘下9a裸坡上9b裸坡中9c裸坡下10a坡+茶叶上10b坡+茶叶中10c坡+茶叶下11a小蓬草1土样秭归港11b小蓬草1根际土秭归港12a小蓬草1土样秭归港12b小蓬草1根际土秭归港13a小蓬草1土样秭归港13b小蓬草1根际土秭归港  2. biolog实验步骤 2.1土样前处理 2.1.1 实验器具 1L 锥形瓶x1或500ml x2、100ml锥形瓶 x 30 、1L烧杯 x 1, 500ml烧杯 x 2、50ml离心管x 30、中型枪头1盒、勺子若干。 2.1.2 实验步骤 配置0.85g/ml的NaCl溶液 称取8.5g 氯化钠置于 1L 烧杯中，分装到20个100 ml的锥形瓶中，每个49ml. 称取4.25g氯化钠置于500ml烧杯中，分装到10个100ml的锥形瓶中，每个49ml. 用封口膜封口，在高压灭菌锅中灭菌。 土样的处理 将天平移入超净工作台，用无菌勺子称取1g土样于锥形瓶中。 超声处理1min，使除石头外土壤全部溶解。 将处理好的土样放入4℃ 冰箱中，备用。 土样溶液稀释 准备1L 无菌水，具体步骤为：用纯水机取1L超纯水(DO)于锥形瓶中，封口膜封住，置于高压灭菌锅中灭菌。 将无菌水分装入50ml离心管中，每个离心管各20ml。 用移液枪吸取20ul土样溶液，置于20ml无菌水中，离心管于4℃冰箱中冷藏保存。 2.2 biolog微平板实验 2.2.1 实验器具 8通道加样枪、biolog专用枪头若干、biolog样槽若干、biolog ECO微平板x 30、泡沫保温箱。 2.2.2 实验步骤 将8通道 biolog枪头，样品槽用锡箔纸或报纸包好在高压灭菌锅中灭菌。 准备好biolog ECO微平板，把离心管中土壤溶液倒入样品槽。 将加样枪调到program1（950ml）模式，加样枪吸取一次溶液只能加样6次，一块ECO板需要吸两次液。 依次把样品加入30个EC0板中，测试0小时吸光度，之后放于泡沫箱中进行无光培养（土壤中无光）将泡沫箱放于室温光照培养箱中培养。每隔24小时测试吸光度。